江必武， 葉麗華， 王 平△

1武漢市第一醫(yī)院消化內(nèi)科，武漢 430022

2華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院感染科，武漢 430030

乙型肝炎在全球廣泛分布，在我國顯得更為突出，據(jù)統(tǒng)計在我國50%肝硬化和70%～90%肝癌由慢性HBV 感染引起，這與HBV 具有病毒復制產(chǎn)量高（1012～1013病毒粒／d）和突變率高（1010～1011點突變／d）等特征有關(guān)。長期點突變累積形成了不同的基因型，迄今為止，HBV 基因型可以分為8個型，即A、B、C、D、E、F、G 和H 型［1－2］。在眾多影響HBV 感染后轉(zhuǎn)歸的因素中，HBV 基因型及基因突變起著重要作用。雖然HBV 基因型能在一定程度上解釋乙型肝炎的病情程度、預后和轉(zhuǎn)歸，但我們也發(fā)現(xiàn)，相同基因型的HBV 可引起不同的臨床表現(xiàn)。近年來我們分析了500 例慢性HBV 感染者的HBV 基因型，旨在探討HBV 基因型與相關(guān)慢性肝病的相互關(guān)系及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

500例慢性HBV 感染者來自2009～2011年武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院門診及住院患者，男性284例，年齡（46.7±15.7）歲；女性216 例，年齡（46.0±15.5）歲。慢性乙型病毒性肝炎262 例，其中輕度122例、中度125例、重度15例；乙型肝炎后肝硬化206例，其中代償期56例、失代償期150例（腹腔積液85例，脾亢102例，食管胃底靜脈曲張48例）；原發(fā)性肝細胞癌32例。診斷均符合衛(wèi)生部行業(yè)學會頒布的2000年《病毒性肝炎防治方案》及2010年《慢性乙型肝炎防治指南》，并排除混合感染其它類型病毒性肝炎。肝癌患者乙型肝炎表面抗原陽性，臨床診斷為肝細胞癌。采集靜脈血10mL，留取血清標本保存于－80℃冰箱備用，進行血常規(guī)、肝功能、乙肝標記物、HBV－DNA定量及基因分型等檢測。

1.2 試劑和儀器

PCR 酶體系購自Clontech 公司。dNTP 購自上海生工生物技術(shù)公司。PCR 產(chǎn)物回收試劑盒購自美國OMEGA 公司。DL2000 分子量標記物購自北京天根生物科技公司，瓊脂粉為日本進口分裝，ABI公司的9700 型PCR 熱循環(huán)儀。大型高速離心機為美國SORVALL 公司的RC6。將HBV 全基因組分為有重疊的S、SX、CX、SC 4 個區(qū)段設計引物，引物設計方法參照文獻［3］，送上海Invitrogen公司合成。

1.3 HBV－DNA基因型檢測

基因型檢測采用第一軍醫(yī)大學基礎生物醫(yī)學診斷研究中心提供的HBV 基因分型PCR 微板核酸雜交－ELISA 試劑盒，檢測方法按說明書進行。

1.4 檢測指標

肝功能、乙肝標記物、HBV DNA 定量（copies／mL）檢測。肝功能檢測采用全自動生化分析儀檢測白蛋白、球蛋白、總膽紅素（TBIL）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）等；檢測HBsAg、抗－HBs、HBeAg、抗－HBe、抗－HBc 等采用ELISA 法，試劑由上?？迫A生物技術(shù)有限公司提供；HBV DNA 采用免疫熒光定量PCR 檢測，試劑購自中山大學達安基因股份有限公司，試劑盒檢測下限5×102copies／mL。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料組間均數(shù)比較采用t檢驗，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 乙肝標記物、HBV－DNA在相關(guān)肝病中的分布情況

500例患者中乙肝標記物HBeAg總的陽性率為50.2%（251／500），其中在輕度慢性肝炎中占49.2%（60／122），在中度慢性肝炎中占54.4%（68／125），在重度慢性肝炎中占73.3%（11／15）；HBeAb總的陽性率為48.2%（241／500）；HBV－DNA 總的陽性率為28%（140／500），其中在中度慢性肝炎中占40%，在重度慢性肝炎中占60%。見表1。

表1 乙肝標記物、HBV－DNA 分布情況Table 1 Distribution of HBV markers and HBV－DNA

2.2 HBV－DNA基因分型

在500例慢性HBV 感染者中檢測出140 例HBV－DNA 陽性，其HBV－DNA 基因型分布：B 型66例（47.1%），C 型74 例（52.9%），沒有發(fā)現(xiàn)A、D、E、F、G 和H 型。各種肝炎病變組的基因型構(gòu)成差異有統(tǒng)計學意義，B 基因型在慢性肝炎（中度、重度）所占百分比高于B 型差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝4.45，P＜0.01）；C 型在肝硬化中所占的百分比顯著高于B 型（χ2＝11.06，P＜0.01）；而在肝細胞癌中B 型和C 型所占百分比差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

2.3 基因型與肝功能受損的關(guān)系

140例感染基因B、C型的患者在丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、γ－谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（γ－GT）、總膽紅素（TBIL）和HBV－DNA 含量差異均無統(tǒng)計學意義，而白蛋白（ALB）的改變在B、C 型中差異有統(tǒng)計學意義（t＝3.07，P＜0.05）。見表3。

表3 基因型與肝功能的關(guān)系（±s）Table 3 The relationship between genotype and liver function（±s）

表3 基因型與肝功能的關(guān)系（±s）Table 3 The relationship between genotype and liver function（±s）

t＝3.07，＊P＜0.05

基因型例數(shù)ALT（U／L）TBIL（μmol／L）γ－GT（U／L）ALB（g／L）HBV－DNA（copies／mL）B型66 163.0±48.4 64.3±37.8 110.0±54.2 37.2±12.4 5.08±1.12 C型74 159.0±47.8 62.5±38.3 112.0±56.3 28.5±8.6＊5.22±1.23

3 討論

自1998年Okamoto等［4］通過對18 株不同血清型的HBV 全基因組序列進行比較后發(fā)現(xiàn)，同一血清型HBV 的基因序列并不相同。由此拉開了學者們對乙型肝炎病毒基因型及其亞型深入研究的序幕。根據(jù)全基因組序列的差異≥8%，或S基因組序列的差異≥4%，將HBV 株分為A～H 8 種基因型。近年來，國內(nèi)外學者對HBV 流行病學進行了大量的研究，目前已基本明確，HBV 存在地理性分布差異。我國以B和C基因型為主，南方以B型為主，北方以C型為主。本研究采用PCR 微板核酸雜交－ELISA 法檢測本地區(qū)140例HBV－DNA 陽性患者的基因型，結(jié)果顯示C基因型74例，占52.9%，B基因型66例，占47.1%，提示本地區(qū)HBV 感染者基因型以C型稍占優(yōu)勢。

HBV 感染后的臨床轉(zhuǎn)歸受多種因素的影響，HBV 基因型可能是其中重要因素之一。本研究對500例HBV 相關(guān)慢性肝病患者同時進行乙肝標記物、HBV－DNA 檢測，結(jié)果顯示：HBeAg 陽性率為50.2%（251／500）；HBeAb 陽性率為48.2%（241／500）；HBV－DNA 陽性率為28%（140／500）。有文獻報道HBV 基因型與病毒復制水平及病毒標志物的表達有一定的相關(guān)性，提示基因型B 的HBeAg血清轉(zhuǎn)換率比基因型C 要高，基因型C 較基因型B有較高的HBeAg 陽性率［5］。目前認為，不同地區(qū)的優(yōu)勢基因型反映了HBV 自然感染史發(fā)生的變異特點，是病毒變異后進化的結(jié)果。研究顯示B 基因型與較輕的病變有關(guān)，C 基因型與較重的病變有關(guān)［6］。本組資料研究結(jié)果亦顯示，B、C 基因型在慢性肝炎（輕度）、肝硬化（代償期）與HBV－DNA 水平及肝功能間差異無統(tǒng)計學意義，但肝組織學改變、血清白蛋白與基因型顯著相關(guān)，在慢性肝炎（中、重度）中B基因型顯著高于C基因型，差異具有統(tǒng)計學意義；而在肝硬化（失代償期）C 基因型顯著高于B 基因型，差異具有統(tǒng)計學意義。

隨著分子生物學技術(shù)的不斷進展，對HBV 基因型的研究也將越來越深入，HBV 基因型及其亞型的研究豐富了HBV 分子流行病學內(nèi)容，對HBV 相關(guān)肝細胞癌（HCC）的臨床診斷、療效判斷、預后分析等均具有重要的指導意義。通過本研究了解到湖北地區(qū)HBV－DNA 基因型分布以B、C兩型為主，為我們以后就B、C基因型及亞型做進一步深入研究、重點了解其與慢性肝炎、肝硬化、原發(fā)性肝癌的關(guān)系及其作用機制打下基礎，從而為我國，特別是為湖北地區(qū)原發(fā)性肝癌的一級預防和二級預防提供了重要實驗和理論依據(jù)，為提出切實有效的綜合防治措施以降低原發(fā)性肝癌發(fā)生率具有重要意義。

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