張登文， 吳煥兵， 張傳漢， 夏 輝， 徐 林， 姚文龍， 田玉科， 王學(xué)仁△

1華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院麻醉學(xué)教研室，武漢 430030

2武警湖北省總隊醫(yī)院麻醉科，武漢 430061

醫(yī)學(xué)技術(shù)的進步大大提高了癌癥患者的5年生存率。隨之凸現(xiàn)的問題是癌癥引起的疼痛嚴(yán)重影響著患者生活質(zhì)量，其中以骨癌痛為典型代表。骨癌痛一般是由原發(fā)性的腫瘤或其他部位的腫瘤轉(zhuǎn)移所引起的痛覺過敏、痛覺超敏，具有自發(fā)性。TRESK（TWIK－related spinal cord K＋channel）是近年新發(fā)現(xiàn)的一種雙孔鉀通道，它主要定位于脊髓和背根神經(jīng)節(jié)，是一種重要的背景鉀離子通道。最近發(fā)現(xiàn)TRESK 的突變與家族性偏頭痛有關(guān)［1］。但是TRESK 在骨癌痛發(fā)生與維持過程中的作用并不十分清楚。因此，本研究擬觀察骨癌痛大鼠脊髓背角TRESK 的表達變化，為進一步探討骨癌痛的發(fā)病機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級雌性SD 大鼠12只，體重150～180g，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部提供，飼養(yǎng)于同濟醫(yī)院實驗動物中心，室溫20～24℃，濕度約60%。將大鼠隨機分為假手術(shù)組（Sham 組）和骨癌痛組（BCP組），每組6只大鼠。

1.2 骨癌痛大鼠模型的制備

大鼠用10%水合氯醛麻醉后（3mL／kg），仰臥固定于操作臺上，備皮后碘伏消毒右側(cè)后肢皮膚，于脛骨上段切開皮膚，鈍性分離肌肉骨膜組織，暴露脛骨，在脛骨結(jié)節(jié)下方0.5～1.0cm 處的脛骨平臺上用23G 的注射器針頭垂直鉆孔至骨髓腔，再用20 μL微量注射器將10μL Walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞（3×104個）懸液緩慢注入骨髓腔內(nèi)。注射完畢后，用醫(yī)用骨蠟封住針孔，消毒皮膚切口，局部給予少許青霉素后縫合肌肉、皮膚。Sham 組大鼠予骨髓腔內(nèi)注射10μL的D－Hanks液。

1.3 機械痛閾測定

各組大鼠在手術(shù)前1d測定基礎(chǔ)機械縮足閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT），取平均值為基礎(chǔ)值。各組大鼠均在術(shù)后3、5、9、14d，用Von－Frey纖維絲（美國Stoeling公司）以up－down法［2］測定術(shù)側(cè)的MWT。

MWT 的測定：將大鼠置于一透明玻璃箱內(nèi)，待其適應(yīng)20min后，用Von－Frey纖維絲垂直刺激大鼠右后肢足底皮膚表面，持續(xù)時間≤6s，大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為視為陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。首次測定從2g開始，當(dāng)該力度的刺激不能引起陽性反應(yīng)時，給予大一級力度的刺激；如出現(xiàn)陽性反應(yīng)則給予小一級力度的刺激，如此連續(xù)進行，直至出現(xiàn)第一次陽性和陰性反應(yīng)的騎跨，再連續(xù)測定4 次。最大力度為15g，大于此值時記為15g。每次刺激間隔30s。

1.4 KATP通道的免疫組織化學(xué)染色

術(shù)后14d，大鼠分別用10%水合氯醛麻醉后，行左心室－主動脈插管，依次用4℃生理鹽水200mL及含4%多聚甲醛400mL灌流。取腰膨大段脊髓，4%多聚甲醛后固定，30%蔗糖脫水至組織沉底后，行冰凍切片，片厚20μm。PBS漂洗5 min×3次，山羊血清封閉15 min 后加入兔抗鼠TRESK（1∶200），4℃過夜。PBS漂洗5min×3次，加入FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶100）孵育1h，PBS 漂洗5 min×3次，熒光顯微鏡下觀察。

1.5 Western blot檢測

術(shù)后14d，每組取4只大鼠，麻醉后處死，取脊髓腰膨大組織，用RIPA 裂解液提取組織總蛋白，并用分光光度儀測定蛋白濃度。將100μg的蛋白用5%的濃縮膠及10%的分離膠進行電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉室溫下封閉1h，一抗（TRESK 1∶500，GAPDH 1∶5 000）4℃孵育過夜，洗膜后辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000）室溫下孵育1h。漂洗后加入ECL 發(fā)光試劑，用BIORAD GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)進行成像分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 機械痛閾值的變化

兩組大鼠術(shù)前MWT 值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；BCP 組在手術(shù)后5d機械痛閾值開始降低，與Sham 組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠不同時點機械縮足閾值的變化（g，±s，n＝6）Table 1 The changes of MWTs of rats at different time points（g，±s，n＝6）

表1 各組大鼠不同時點機械縮足閾值的變化（g，±s，n＝6）Table 1 The changes of MWTs of rats at different time points（g，±s，n＝6）

與Sham 組比較，＊P＜0.05；與手術(shù)前1d比較，＃P＜0.05

術(shù)后時間（d）組別術(shù)前1d 3 5 9 14 Sham 15.0±0.3 14.3±1.2 15.2±0.9 14.8±1.2 15.1±1.3 BCP 14.6±0.7 14.1±1.9 8.3±0.7＊＃6.4±0.9＊＃3.2±0.4＊＃

2.2 TRESK 蛋白的表達

如圖1所示，TRESK的表達主要位于脊髓背角。Western blot檢測結(jié)果也顯示，BCP組的TRESK 蛋白的表達較Sham 組明顯減少（P＜0.05），見圖2。

圖1 大鼠脊髓腰膨大術(shù)側(cè)背角組織TRESK 免疫熒光染色（A、C：×40，B、D：×200）Fig.1 Immunofluorescence staining of TRESK in the spinal dorsal horn of rats（A，C：×40，B，D：×200）

圖2 大鼠脊髓腰膨大術(shù)側(cè)背角組織TRESK 表達變化Fig.2 The changes in expression of TRESK in rat spinal dorsal horn

3 討論

向脛骨骨髓腔注入Walker 256 乳腺癌細(xì)胞制備大鼠脛骨癌痛模型是比較成熟的骨癌痛模型［3］。本研究結(jié)果表明，在接種癌細(xì)胞5d后大鼠的機械痛閾值開始明顯降低，表明模型制備成功。

骨癌痛機制復(fù)雜。脊髓背角是疼痛信息傳遞和整合的初級中樞，也是機體對于傷害性信息進行自身調(diào)制或整合的重要位點之一。目前研究認(rèn)為脊髓中樞敏化在神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生和維持中起著重要的作用。中樞敏化是指傷害性刺激傳入引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疼痛傳遞神經(jīng)元興奮性增高及突觸的可塑性改變［4］。神經(jīng)元興奮性增高導(dǎo)致一些本不該產(chǎn)生自發(fā)放電活動的部位產(chǎn)生自發(fā)放電現(xiàn)象，即異位放電。

鉀離子通道的生理作用是維持細(xì)胞膜的靜息電位，使動作電位復(fù)極化，決定著神經(jīng)元的放電頻率等。抑制鉀通道可以使異位放電的頻率增加，提示鉀通道參與了異位放電的形成。Everill等［5］發(fā)現(xiàn)坐骨神經(jīng)損傷后，受損的DRG 大神經(jīng)元的鉀電流明顯下調(diào)，其中IA 降低60%，IK 降低65%，ID 無明顯變化。同時在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)開胸術(shù)后大鼠胸段脊髓背角神經(jīng)元中的ATP敏感性鉀離子通道的表達是降低的，在坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷大鼠模型中也得到同樣的結(jié)果［2，6］。

TRESK，雙孔微弱的內(nèi)向整流鉀通道（TWIK）相關(guān)的脊髓鉀通道，是近年新發(fā)現(xiàn)的一種雙孔鉀離子通道（K2P），它與其他的鉀離子通道包括電壓門控（Kv）、鈣激活（Kca）和內(nèi)向整流器（Kir）通道在分子結(jié)構(gòu)、電生理和藥理性質(zhì)方面區(qū)別很大。K2P 的離子選擇通道亞基由4次跨膜（TMA1－4）和雙孔形成區(qū)（P1，P2）組成，而其它的鉀通道亞基由2、6或8次跨膜片段和一個保守孔形成區(qū)組成。K2P電流在所有的細(xì)胞膜電位中都能觀察到，而且能被電壓躍階即時地激活且沒有顯示激活所需的電壓閾值，這也是能把它們從其它的鉀電流中辨別出來的原因。因此，它能產(chǎn)生漏電流來幫助形成和穩(wěn)定靜息電位并且在生理條件下影響細(xì)胞興奮性［7－8］。TRESK主要定位于脊髓和背根神經(jīng)節(jié)，是一種重要的背景鉀離子通道［9］。Kang等［10］發(fā)現(xiàn)在24℃時背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元主要的背景鉀離子通道是TRESK。Lafreniere等［1］發(fā)現(xiàn)在典型家族性偏頭痛患者中TRESK 的基因發(fā)生了移位突變，TRESK 突變后，患者會更容易感到頭痛，對光線、聲音和觸碰也變得更敏感。

本研究結(jié)果顯示，骨癌痛大鼠脊髓背角TRESK 的表達較Sham 組明顯降低。這表明，TRESK 可能參與了骨癌痛的發(fā)生。其他的研究也發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)病理性疼痛中大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)TRESK 的表達降低［11－12］。我們推測在神經(jīng)損傷或受壓后，可能導(dǎo)致背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和脊髓背角神經(jīng)元細(xì)胞膜上的TRESK 表達降低，從而使鉀離子外流減少，細(xì)胞膜的靜息電位升高，神經(jīng)元的興奮性增加，放電頻率增加，導(dǎo)致異位放電，形成中樞敏化。

綜上所述，脊髓背角神經(jīng)元膜上的TRESK 在骨癌痛中可能起重要的作用。但骨癌痛改變TRESK 基因表達的具體機制還有待進一步探討。

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