潘開瑞 劉衛(wèi)紅

(1.河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院制劑室 河南鄭州 450000;2.河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院中心實驗室 河南鄭州 450000)

隨著人民生活水平的提高和生活方式的改變,肥胖已成為多發(fā)病和影響人類健康的危險因素之一,成為迫切需要解決的問題。脂肪組織包含脂肪細胞、前脂肪細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞,脂肪組織分泌的50余種生物活性分子統(tǒng)稱為脂肪因子。這些脂肪因子通過自分泌、旁分泌、內(nèi)分泌作用方式,形成代謝-神經(jīng)內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡。當機體長期處于能量過度攝入狀態(tài)時,脂肪組織在其體積增大的同時,分泌各種脂肪因子參與代謝綜合征各組分如胰島素抵抗、2型糖尿病、血脂紊亂、高凝狀態(tài)等的發(fā)生,并可直接作用于血管,促發(fā)動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[1,2]。

充分理解脂肪因子功能,治療才能更加有效和明確,中醫(yī)藥以整體觀辨證論治,防治結合,更符合減肥基本原則,臨床應用澤瀉治療肥胖癥,取得了較好的臨床療效,本實驗通過觀察其對體外培養(yǎng)的前體脂肪細胞增殖以及凋亡的影響,以期揭示其治療單純性肥胖療效產(chǎn)生的分子機制,為減肥中藥推廣應用提供理論依據(jù)。

1 材料

(1)細胞株:3T3-L1細胞株購自中科院上海細胞所。(2)試劑:RPMI1640培養(yǎng)基,胰蛋白酶、胎牛血清,SDS(十二烷基硫酸鈉)、EDTA(乙二胺四乙酸),96孔細胞培養(yǎng)板;吖啶橙。(3)儀器:Milli-Q型超純水儀(美國Milipore公司),CK40倒置顯微鏡(日本Olympus公司),CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司),熒光顯微鏡BX41。(4)試藥:澤瀉購自河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院藥房,水煮提取,高壓滅菌,4℃?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 3T3-L1細胞培養(yǎng)及實驗分組

細胞在含有100IU·L-1青霉素和100μg·mL-1鏈霉素、10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基,37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。實驗細胞分為正常對照組,不同濃度澤瀉(0.001-10mg/ml)組。

2.2 細胞形態(tài)學觀察

將對數(shù)生長期細胞調(diào)制成密度約1×105·mL-1的細胞懸液,加入96孔板,每孔100μL,37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24h,待細胞貼壁后,更換無血清培養(yǎng)基,加入不同濃度的澤瀉(0.001-10mg/ml),倒置顯微鏡下觀察,同時記錄細胞生長的形態(tài)學變化。

2.3 AO/EB染色法檢測細胞凋亡

根據(jù)MTT實驗結果,選取10mg/ml組作為刺激組。在6孔培養(yǎng)板中預先置入玻璃蓋玻片,接種細胞懸液,10mg/ml澤瀉干預后,予95%乙醇固定15分鐘,微干,然后準備熒光染色。將100mg/L溶于PBS的吖啶橙和100mg/L溶于PBS的溴化乙錠各5μl在照相前混勻后加入,輕輕吹打,30秒后用熒光顯微鏡觀察照相。觀察正常對照組和10mg/ml澤瀉組凋亡情況。

3 結果

3.1 澤瀉對前體脂肪細胞增殖的影響

結果如圖1所示,不同濃度的澤瀉作用于前體脂肪細胞24小時候,細胞增殖發(fā)生變化,各組間細胞活性比正常組降低,且10mg/ml組與對照組相比,差異具有統(tǒng)計學意義。(圖1)

3.2 凋亡形態(tài)學改變

結果圖2所示,光鏡下可見細胞貼壁生長,長梭形,經(jīng)過AO/EB染色后,胞核為均一,均質的綠色熒光,經(jīng)過中藥刺激組可見細胞核邊聚,固縮,可見溴乙啶染色的橙黃色熒光。（圖2）

4 討論

圖1 不同濃度澤瀉作用于前體脂肪細胞的細胞的MTT增殖活性(0.001-10mg/ml)

流行病學研究表明,我國青少年單純性肥胖癥已處于失控的奇高狀態(tài)。脂肪組織被認為不僅是能量儲存器官,而且是功能活躍的內(nèi)分泌器官。脂肪因子在代謝綜合征的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用,尤其是肥胖時內(nèi)臟脂肪組織分泌的促炎癥脂肪因子可直接導致胰島素抵抗和血管損傷,等[3,4]?；谥疽蜃訛樗幬锇悬c的減肥防治策略已成為比較關注的方向。臨床中許多中草藥在治療肥胖中具有較好的療效,因此,中藥成分對肥胖的作用已成為關注的熱點[5]。

圖2 前體脂肪細胞的凋亡形態(tài)學改變:A,B,C組為正常對照組的光鏡照片,D,E,F組為正常組染色結果;G,H,I組為刺激組的染色結果

本實驗結果顯示,不同濃度的澤瀉(0.001-10mg/ml)作用前體脂肪細胞24h使細胞增殖活性下降,能夠明顯抑制細胞的增殖,并且呈現(xiàn)劑量依賴性,10mg/ml組與正常對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。提示澤瀉有可能具有抑制細胞增殖作用。

細胞正常情況和早期凋亡情況下,細胞核染色亞啶橙染色,當細胞處于晚期凋亡時候,溴乙啶染色細胞核。AO/EB凋亡染色結果顯示,正常組細胞細胞核亞啶橙染色,而10mg/ml的澤瀉作用后細胞核溴乙啶著色。這與MTT結果相吻合,提示澤瀉可能通過抑制細胞增殖并誘導凋亡來做用于前體脂肪細胞。這可能為中藥減肥藥物的作用機理提供一定的理論依據(jù)。之后的實驗還將從脂肪因子相關基因及其蛋白表達活性進一步闡述澤瀉對前體脂肪細胞作用的機理。

[1]路玲玲,宰軍華,崔琳,李強,張莎莎,金小琴.人脂聯(lián)素基因啟動子熒光素酶報告基因載體的構建[J].世界科學技術——中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2013,15(1):55-61.

[2]崔琳,李強,路玲玲,宰軍華,張莎莎.脂聯(lián)素調(diào)控序列熒光素酶報告基因熒光素酶活性的分析[J].中國實驗方劑學雜志.2013,19(6):211-215.

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[5]孫陽,陳樹春.內(nèi)皮祖細胞與脂肪因子[J].中國老年學雜志,2012,32(6):1312-1314.