破傷風桿菌發(fā)酵液澄清過濾試驗

吳永超 楊國有 唐朝暉 張華 楊金亮 秦敏*

(1.四川大學生物治療國家重點實驗室 四川成都 610041;2.成都生物制品研究所有限責任公司菌苗一室 四川成都 610023)

破傷風(Tetanus)是由破傷風梭狀芽孢桿菌的感染引起的嚴重感染性疾病,在發(fā)展中國家仍是一個主要的公共衛(wèi)生問題,一般估計每年死于破傷風的人數(shù)約為100萬,其中約80%為新生兒。早在19～20世紀,已證明破傷風是由破傷風梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生的破傷風毒素引起的,并獲得了用毒素脫毒制成類毒素預防破傷風的有效方法。破傷風類毒素制劑主要有破傷風疫苗、白喉破傷風聯(lián)合疫苗以及百日咳-白喉-破傷風聯(lián)合疫苗。我國主要采用無細胞百白破聯(lián)合疫苗(DTaP)對兒童進行計劃免疫,100%的被免疫者可達到保護水平以上,且10-15年仍有80%的人群其抗體仍在保護水平之上[1][2]。破傷風類毒素也常作為蛋白載體用于結(jié)合疫苗,如b型流感嗜血桿菌-破傷風類毒素(Hib-TT)結(jié)合疫苗,14型肺炎球菌莢膜多糖－破傷風類毒素結(jié)合疫苗等。

圖1 Vmax 恒壓試驗示意圖Fig 1 Schematic diagram of Vmax

圖2 Pmax 恒流試驗示意圖Fig 2 Schematic diagram of Pmax

破傷風類毒素制備采用破傷風桿菌于液體產(chǎn)毒培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng),發(fā)酵液澄清過濾去除菌體后超濾濃縮,再經(jīng)純化后甲醛脫毒制成類毒素。澄清過濾從最初的帆布過濾,過渡到板框濾器過濾。板框濾器采用EKS濾板過濾,為半開放式,EKS濾板的吸附損失較大,過濾時常常需要更換濾板,對制品和環(huán)境都存在較大的安全風險。為符合GMP要求,本文選用表面濾器P olyse p II C GW3(1.0/0.2um)和深層濾器Millistak+X0HC(0.2um)兩種密閉式濾器進行破傷風桿菌發(fā)酵液澄清過濾對比試驗,考察兩種濾器的澄清效果和對破傷風毒素的吸附情況,并對實際工藝所需的膜面積進行推算,篩選合適的濾器類型,選擇出一種安全經(jīng)濟高效的過濾器。

圖3 Polysep II CGW3 Vmax 試驗曲線Figure 3 the curves of Polysep II CGW3 Vmax test

圖4 Millistak+ X0HC Pmax 曲線Figure 4 the curve of Millistak+ X0HC Pmax

1 材料和方法

1.1 試驗樣品

1.2 主要試劑及儀器

破傷風抗毒素國家標準品購自中國食品藥品檢定研究院;表面濾器Polysep II CGW3面積13.8 cm2,深層濾器Millist ak+X0HC面積26cm2,均由Merck millipore公司提供;JY10001電子天平為上海精密科學儀器有限公司產(chǎn)品;Micro 950濁度儀為英國百靈達有限公司產(chǎn)品;BT100-2J恒流泵為保定蘭格恒流泵有限公司產(chǎn)品。

1.3 Vmax試驗

Vmax試驗即恒壓試驗,即在恒定壓力下使料液通過過濾器,并在一定時間間隔記錄濾液體積, 其基本原理是依據(jù)濾膜逐漸堵塞模型方程,通過計算可預知濾器的最大負載和流量衰減,從而進行過濾器的選型放大[4],適用于Polysep II CGW3(1.0/0.2um)表面濾器。

按(圖1)所示安裝系統(tǒng),準備約2 L料液,設定過濾壓力恒為10psi,當?shù)谝坏瘟弦哼M入收集容器時開始秒表計時,持續(xù)約10分鐘,在適當時間間隔測定濾液體積(測定重量轉(zhuǎn)換)及毒素絮狀單位,并對濾液的濁度進行檢測。根據(jù)記錄的數(shù)據(jù)計算出Polysep II CGW3(1.0/0.2um)表面濾器的通量,載量,T/V等。

1.4 Pmax 試驗

Pmax試驗即恒定流速試驗,以恒定的流速使料液通過濾器,記錄一定時間間隔的過濾器壓降和濾液體積,當濾器的壓降達到設定值(基本完全堵塞的壓力值)時停止試驗。對于以吸附為主要截留方式的過濾,以濁度的貫穿(吸附位點基本飽和)作為試驗終止的依據(jù)。深層過濾不符合逐漸堵塞模型,不適用于Vmax試驗,故Millistak+X0HC深層濾器采用Pmax試驗。

按(圖2)所示安裝系統(tǒng),設定恒定流速為12ml/min(通量為281.4LMH),記錄一定時間間隔的過濾器壓降和濾液體積及毒素絮狀單位,試驗過程中同時測量濾液濁度,當濁度貫穿(比初始值高40～50%)或者達到壓力上限時(15～20psi),試驗終止。

2 結(jié)果

2.1 Vmax 試驗結(jié)果

從(表1)中可看出,隨著時間增加,濾器的載量逐漸升高,通量逐漸降低,但在各時間段料液的毒素絮狀單位與濾前相比沒有變化,均為120lf/ml,說明Polysep II CGW3濾器對破傷風毒素的吸附很小,損失可以忽略不計。濾前料液濁度為14.2NTU,過濾后為4.72NTU,說明澄清過濾效果較好。

以t(min)為橫坐標,t/V(min/ml)為縱坐標作出Vmax試驗曲線圖如圖3,其R2值=0.9991>0.99,說明Vmax逐漸堵塞模型的有效性。

表1 Vmax 試驗數(shù)據(jù)Table 1 Vmax test date

表2 Pmax 試驗數(shù)據(jù)Table 2 Pmax test data

具有工藝時間限制的濾膜面積計算公式為:Area=Vb/Vmax+Vb/(QiTb)[3],其中Vb為工藝體積,Vmax為最大過濾體積,Qi為起始流量,Tb為工藝時間。

根據(jù)圖3,Vmax=1/0.0015=666.7ml,濾膜面積為13.8cm2,單位面積Vmax(即最大載量)=0.6667ml/0.00138m2=483.1L/m2。同理,Qi=1/0.0038=263.2ml/min=15.79L/h,單位面積的Qi=11442.0L/m2h。

與一般項目不同，科研項目通常具有研究周期長、技術(shù)難度大、投資規(guī)模大、不可預見性大等特征。因此，科研項目管理的難度也較大。企業(yè)作為科研項目實施主體之一，應該加強項目全過程管理、重視科研項目的轉(zhuǎn)化和推廣、加強科研項目經(jīng)費管理，提高科研項目管理的有效性。

若需2 h 內(nèi)完成6 00 L料液的過濾,所需的該種膜面積=V b/Vmax+Vb/(Qi×Tb)=1.27m2。若過濾時間為1h,則所需最低膜面積=1.29m2。

2.2 Pmax 試驗結(jié)果

由（表2）可知,在過濾速度基本恒定的情況下,隨著過濾時間延長,過濾壓力逐漸增大,濾液濁度逐漸升高,濾器的載量升高,但各時間段料液的毒素絮狀單位與濾前相比沒有變化,均為120lf/ml,說明Millistak+XOHC濾器對破傷風毒素的吸附可忽略不計。濾前料液濁度為14.2NTU,過濾后為2.06NTU,澄清過濾效果好。

以載量為橫坐標,壓阻(psid/LMH)為縱坐標作出Pmax曲線圖[4][5],如圖4:

由表2及圖4,Millistak+XOHC濾器過濾約1.2L后,濾器壓降上升至10psi,若要求600L料液過濾時間為1h,根據(jù)圖4中公式可計算出濾器最大載量為349L/m2,則使用最低濾膜面積為1.72m2。若延長過濾時間為2h,則濾器載量可提高至511L/m2,最低濾膜面積為1.18m2。

2.3 比較

由(表3)可看出,Millistak+X0HC濾器和Polysep II CGW3濾器對破傷風毒素的吸附都很小,Millistak+ X0HC濾器的澄清過濾效果要優(yōu)于Polysep II CGW3濾器。

若要求1～2小時內(nèi)完成600L料液的過濾,根據(jù)計算結(jié)果得出(表4),Millistak+X0HC濾器的最大載量受過濾時間的影響較大,過濾時間越短,要求濾器的膜面積越大;而Polysep II CGW3濾器的最大載量受過濾時間的影響很小。

2.4 放大應用

根據(jù)兩種濾器的小量試驗結(jié)果,兩種濾器對破傷風毒素的吸附均很小,Millistak+X0HC濾器的澄清過濾效果要略優(yōu)于Polysep II CGW3濾器,但Millistak+X0HC濾器的載量受過濾時間的影響,對過濾條件的要求較高。Polysep II CGW3濾器的最大載量比較穩(wěn)定,且在實際生產(chǎn)中,須在最低需求面積基礎上設定一個1.2～1.5倍左右的安全系數(shù),濾液濁度還可以下降。故選擇Polysep II CGW3濾器進行了放大試驗,與板框濾器過濾進行比較,結(jié)果如表5:

表3 兩種濾器過濾結(jié)果比較Table 3 Comparison of the results of two kinds of filters

表4 兩種濾器需求面積比較Table 4 Comparison of the area of two kinds of filters

表5 放大試驗結(jié)果Table 5 the results of scale-up test

3 討論

通過小量試驗中兩種濾器在毒素吸附、濾液澄清度及膜面積等方面的比較,初步篩選出Polysep II CGW3濾器進行放大應用,進一步驗證了其小量試驗結(jié)果。

通過表5,可得出Polysep II CGW3濾器與板框濾器的比較:(1)Polysep II CGW3濾器過濾后濾液濁度雖略高,但對后續(xù)的超濾濃縮無明顯影響;(2)Polysep II CGW3濾器過濾損失很小,只有板框濾器過濾損失的1/20;(3)Polysep II CGW3濾器縮短了整體工藝時間;(4)從經(jīng)濟上考慮,板框濾器使用的濾板為一次性使用,成本較高;(5)Polysep II CGW3濾器為密閉式,大大提高了對制品和環(huán)境的安全性,符合GMP要求。因此,綜合考慮安全、經(jīng)濟、效率等方面因素,Polysep II CGW3濾器可替代板框濾器用于實際生產(chǎn)。

生物制藥業(yè)是目前發(fā)展最活躍、進展最快的產(chǎn)業(yè)之一,21世紀是生物制藥行業(yè)飛速發(fā)展的時代,但中國的生物制藥業(yè)發(fā)展水平仍比較落后,其中支撐技術(shù)和設備的落后是一個主要原因。因此,亟需加強生物制藥行業(yè)的相關(guān)技術(shù)及裝備的產(chǎn)業(yè)化、國際化,不斷促進技術(shù)裝備更新?lián)Q代,中國生物制藥業(yè)才能得到更快更好的發(fā)展。

[1]趙凱,章以浩,李河民.醫(yī)學生物制品學[M].(第2 版).北京:人民衛(wèi)生出版社,2007.10:697-702.

[2]張延齡,張暉.疫苗學[M].(第1 版).北京:科學出版社,2006.03:855-875.

[3]壽建斐.過濾器選擇系列-恒壓載量測試實驗Vmax[J/OL].BIOPROCESS NOW,2009.12(四):4-7. http://wenku.baidu.com/view/0b417c1614791711cc791756.html(2011/7/31).

[4]唐正姣,歐陽貽德,陳中.恒壓過濾實驗數(shù)據(jù)處理的探討[J].化學工程師,2004.06:21-22.

[5]丁啟圣,王維一.新型實用過濾技術(shù)[M].(第3 版).北京:冶金工業(yè)出版社,2011.06.