張坤 譚桂玉 王保民 南鐵貴

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

現(xiàn)代生物工程技術(shù)可以將外源基因?qū)氩⒎€(wěn)定整合于植物體基因組，使其定向遺傳。運用該技術(shù)，近幾十年來轉(zhuǎn)基因作物在全球范圍內(nèi)飛速發(fā)展［1，2］。來源于蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）的cry基因作為其中的代表性基因，可表達晶體毒蛋白，對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目等多種昆蟲和線蟲均有獨特的殺蟲活性。目前，該基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入玉米、棉花、水稻等主要作物，轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米和抗蟲棉在世界各地普遍種植。轉(zhuǎn)Bt基因作物降低生產(chǎn)成本，提高單位面積產(chǎn)量，其優(yōu)點不言而喻，但抗蟲轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的環(huán)境安全性和食品安全性也越來越受到社會的廣泛關(guān)注。雖然研究人員認(rèn)為Bt蛋白只有在昆蟲腸道堿性環(huán)境下才能加工成有殺蟲活性的蛋白，與昆蟲腸道細(xì)胞表面受體結(jié)合，造成昆蟲腸道穿孔［3］。人畜胃環(huán)境為酸性，腸道細(xì)胞表面不含殺蟲蛋白受體，因此轉(zhuǎn)Bt基因作物對人畜是安全的，但大量應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因作物中Bt蛋白對人畜的長期影響仍時有爭議。

作物種子，如玉米、棉花、水稻等，是人類糧食及油料的最主要來源之一?，F(xiàn)今轉(zhuǎn)基因作物的廣泛種植，使轉(zhuǎn)基因作物種子不免進入日常飲食，轉(zhuǎn)基因作物的食品安全引起社會關(guān)注［4，5］。雖然這些作物種子中所含的Bt蛋白在食物加工過程中產(chǎn)生降解，但目前這一方面的研究仍鮮見報道。本研究模擬熱加工處理溫度，檢測玉米、棉花種子在高溫處理條件下，所含Bt蛋白的變化情況，以期為解決轉(zhuǎn)基因食品安全爭論提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 對照常規(guī)棉品種“遼棉18”由河間市國欣農(nóng)研會贈送；轉(zhuǎn)Bt雜交抗蟲棉品種“鄂雜棉10”及“鄂雜棉29”的F1代種子由湖北省農(nóng)牧業(yè)廳提供。對照常規(guī)玉米品種“鄭58”及其雜交轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米品種（研究階段）由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院化控中心提供。

1.1.2 化學(xué)試劑 Bt蛋白檢測所需抗Bt蛋白兔多克隆抗體（pAb）［6］、辣根過氧化物酶標(biāo)記鼠單克隆抗體（HPR-mAb）［7］、Bt標(biāo)準(zhǔn)蛋白均由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院化控中心提供，標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋至濃度100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.625和0 ng/mL作為標(biāo)準(zhǔn)濃度；TMB顯色溶液購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 棉花種子處理 取棉籽去種皮（種子內(nèi)種皮及其以內(nèi)部分未受損傷）于烘箱中進行高溫處理，處理溫度為70℃、85℃、100℃、115℃、130℃，各于5、10、15、20、30、40、50和60 min時取樣并即刻研磨成粉，稱取棉花種子粉末0.1 g，用2 mL Na2HPO4-KH2PO4緩沖液［0.1 mol/L，pH7.5，含1%（W/V）的NaCl和0.1%（V/V）吐溫-20，PBST］在4℃提取過夜。提取液5 000 r/min、4℃離心取上清，即為Bt蛋白待測液。每處理3個重復(fù)。

1.2.2 玉米種子處理 玉米種子分別置于55℃、70℃、85℃、100℃、115℃、130℃進行熱處理，取樣間隔時間及后續(xù)Bt蛋白提取方法同1.2.1。所取玉米種子粉末重量為0.2 g。

1.2.3 Bt蛋白含量測定 熱處理后，棉花及玉米種子提取液按如下步驟檢測Bt蛋白：（1）用Na2CO3-NaHCO3緩沖液（0.05 mol/L，pH9.6）將抗Bt蛋白兔多克隆抗體稀釋到工作濃度后加入酶標(biāo)板，每孔100 μL。酶標(biāo)板放入濕盒并置于37℃培養(yǎng)箱溫育3 h；（2）溫育完成，將酶標(biāo)板從培養(yǎng)箱中取出，棄去孔內(nèi)液體后每孔加入150 μL PBST，在常溫放置1 min，棄去PBST，重復(fù)4次，將板內(nèi)殘留PBST在吸水紙上甩干；（3）在酶標(biāo)板中分別加入50 μL玉米、棉花Bt蛋白待測液、各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，均做3個重復(fù)；（4）將Bt HRP-mAb用PBST（含0.1%明膠）稀釋至工作濃度后加入步驟（3）酶標(biāo)板孔中，每孔50 μL，將酶標(biāo)板放入濕盒中37℃溫育1 h；（5）同步驟（2）；（6）在酶標(biāo)板內(nèi)加入TMB顯色液，每孔100 μL，放入濕盒并于37℃下顯色15 min；（7）顯色結(jié)束后每孔加入100 μL 1 mol/L鹽酸終止酶反應(yīng)；（8）450 nm下測定酶標(biāo)板各孔的OD值；（9）對標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度和相應(yīng)的OD值分別取自然對數(shù)后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品中Bt蛋白的含量。

1.2.4 統(tǒng)計分析 原始數(shù)據(jù)用Excel 2007軟件進行標(biāo)準(zhǔn)曲線建立，用SPSS 17.0軟件進行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 高溫處理對轉(zhuǎn)基因棉花種子Bt蛋白含量的影響

依據(jù)轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗蟲轉(zhuǎn)Bt基因棉花外源蛋白表達量檢測技術(shù)規(guī)范（農(nóng)業(yè)部1485號公告），采用ELISA試劑盒檢測作物種子中外源Bt蛋白的含量。檢測結(jié)果（圖1-A）表明，棉花陰性樣品在常溫和130℃高溫處理條件下，Bt蛋白的檢測結(jié)果無差異，證明所用方法不受雜蛋白影響，可特異性地檢測Bt蛋白。轉(zhuǎn)基因棉花種子中Bt蛋白含量隨高溫處理時間變化趨勢，如圖1-B、圖1-C所示。高溫處理最初的10 min為含量迅速變化期，Bt蛋白含量顯著下降。10 min后含量變化趨于緩和，曲線進入平臺期。隨著處理溫度的升高，棉籽外源Bt蛋白含量在迅速變化期下降速率越快，在平臺期的蛋白含量越低。棉花種子內(nèi)的Bt蛋白含量隨著溫度的升高被降解的速度增快被降解量增大。

2.2 高溫處理對轉(zhuǎn)基因玉米種子Bt蛋白含量的影響

如圖2所示，玉米陰性樣品在常溫和高溫處理條件下，Bt蛋白的檢測結(jié)果無差異，證明所用方法可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因玉米種子Bt外源蛋白的特異性檢測。轉(zhuǎn)基因玉米種子Bt蛋白含量隨高溫處理時間變化趨勢與棉花種子相似，含量變化先為迅速變化期，其后為平緩期，迅速變化期隨溫度變化時間長度不同。隨著溫度的升高，玉米種子Bt蛋白含量被降解速度增快被降解量增大。

圖1 棉花種子在高溫處理條件下Bt蛋白含量的變化

圖2 玉米種子在高溫處理條件下Bt蛋白含量的變化

3 討論

3.1 高溫處理棉花和玉米Bt蛋白含量變化比較

已有的文獻報道中［8-10］，關(guān)于高溫對Bt蛋白的影響均以生長期葉片為材料，研究40℃左右高溫對Bt蛋白的作用，本研究彌補了高溫對種子內(nèi)Bt蛋白影響的研究空白。從本研究結(jié)果可看出，在一定高溫條件下，棉花和玉米種子中的Bt蛋白在短時間處理時間內(nèi)均迅速下降至平臺期。平臺期種子在修復(fù)機制作用下，貯藏蛋白降解不再顯著。棉花種子內(nèi)Bt蛋白含量變化與玉米相比較，70℃處理10 min時，玉米種子中的Bt蛋白含量開始逐漸下降，而棉花種子Bt蛋白含量無顯著變化；85℃處理10 min時，玉米種子中的Bt蛋白含量降解至原含量一半，而棉花種子100-115℃處理10 min時其Bt蛋白被降解至原含量一半；在130℃處理時，棉花和玉米種子中的Bt蛋白含量均迅速下降，并大量降解，處理10 min后，玉米種子的Bt蛋白含量幾乎與本底持平，而棉花種子仍可檢測到少量Bt蛋白。玉米種子Bt蛋白對高溫的耐受程度較棉花種子弱，降解速度較平緩。這些現(xiàn)象與兩種作物種子的組成成分不同有關(guān)。棉花種子富含油分，其耐高溫能力較淀粉類種子及蛋白類種子強，但油分不易散熱，使種子內(nèi)部迅速達到高溫，導(dǎo)致Bt蛋白失活；不同品種的棉花由于種子成分含量不同，降解程度存在差異，但總體變化趨勢一致。

3.2 種子Bt蛋白含量與食品加工

根據(jù)上述試驗結(jié)果，可推測在食品加工時，榨油原料需經(jīng)歷130℃左右的高溫長時間烘烤［11，12］，同時施以高壓，種子內(nèi)的Bt蛋白在成油后已大量減少。而后煎炒等加工，溫度遠(yuǎn)高于130℃，Bt蛋白徹底降解。水煮加工溫度持續(xù)100℃，淀粉類、蛋白類種子中Bt蛋白可顯著降解，但油料種子中仍有Bt蛋白。煎炸烘烤等加工，溫度均高于130℃，持續(xù)一段時間后，可使種子內(nèi)的Bt蛋白完全降解。冷加工或不加工的轉(zhuǎn)基因種子，缺乏熱處理過程，若不采用其他的處理方法，其內(nèi)Bt蛋白含量不減少。

4 結(jié)論

轉(zhuǎn)基因作物種子經(jīng)高溫處理，所含Bt蛋白可顯著降低。在降解過程中，會出現(xiàn)一個迅速下降期，而后蛋白降解緩慢，進入平臺期。隨著處理溫度升高，平臺期所含的Bt蛋白降低。種子成分的不同，所含Bt蛋白對高溫的耐受程度不同。油料種子中的Bt蛋白對高溫的耐受強度高于淀粉類種子。在130℃以上溫度處理，種子Bt蛋白幾乎完全降解。水煮溫度為100℃，Bt蛋白在短時間內(nèi)無法全部降解。而冷加工或不加工食品，需要通過其他方式減少Bt蛋白的攝入。

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