用高效液相色普測(cè)定乳或乳制品中的乳鐵蛋白

廖長(zhǎng)保

(雅士利國(guó)際集團(tuán)有限公司 廣東潮州 515638)

乳鐵蛋白(Lactoferrin,Lf)是1939年由Sorensen等在動(dòng)物乳中發(fā)現(xiàn)的一種功能因子。1960年首先由Groves從牛乳中分離獲得,因與鐵結(jié)合而呈紅色,故稱(chēng)之為“紅蛋白”。在發(fā)現(xiàn)之初,LF被認(rèn)為是一種與鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)和存儲(chǔ)有關(guān)的蛋白質(zhì),所以又稱(chēng)乳轉(zhuǎn)鐵蛋白。乳鐵蛋白是一種具有多種生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)。2004年4月12日,衛(wèi)生部發(fā)布第6號(hào)號(hào)公告,首次允許乳鐵蛋白可在嬰幼兒配方乳粉中添中。目前生乳中的乳鐵蛋白的檢測(cè)方法還很少,本文建立高效液相色譜法對(duì)乳或乳制品中乳鐵蛋白進(jìn)行測(cè)定。

1 儀器設(shè)備

(1)Waters-600E多溶劑遞送系統(tǒng),-600E系統(tǒng)控制器,-600E帶100ml泵頭的溶劑遞送系統(tǒng);(2)Waters486可調(diào)吸光度檢測(cè)器;(3)Waters基線(xiàn)系統(tǒng)控制器;(4)47mm玻璃過(guò)濾器座;(5)47mm,0.45μm纖維素濾膜;(6)錐形燒瓶;(7)真空抽吸裝置;(8)25mm碟形過(guò)濾中座;(9)可設(shè)置小型過(guò)濾器,25mm醋酸纖維素(濾膜);(10)聚丙烯鎖定注射針筒,容量6ml;(11)AE200型分析天平;(12)PH計(jì);(13)磁力攪拌器;(14)燒杯(容量1L,2個(gè));(15)貝克曼微型離心機(jī);(16)容量瓶(容量1L,2個(gè))。

2 材料和試劑

(1)milli-Q(超純水,電飽18兆歐);(2)磷酸氫二鈉(BDH分析級(jí))(分子量142.0);(3)氯化鈉(分子量58.44);(4)正磷酸(BDH分析級(jí)) (分子量98.00)。

3 步驟

3.1 緩沖液的制備

1)緩沖液A:50mM Na2HPO4PH7.00。①稱(chēng)取7.100克Na2HPO4于玻璃燒杯中,用850ml超純水溶解;②將上述溶液用正磷酸溶液調(diào)至PH=7.00;③將調(diào)好PH值的溶液轉(zhuǎn)移到1升的容量瓶中,用超純水定容;④把定容好的緩沖液通過(guò)0.2μm乙酸纖維素過(guò)濾到錐形瓶中。

表1

2)緩沖液B:50mM NaHPO4+1.0M NaCl PH7.00。①稱(chēng)取7.100克Na2HPO4和58.440克NaCl于玻璃燒杯中,用850ml超純水溶解;②將上述溶液用正磷酸溶液調(diào)至PH=7.00;③將調(diào)好PH值的溶液轉(zhuǎn)移到1升的容量瓶中,并用超純水定容;④把定容好的緩沖液通過(guò)0.2μm乙酸纖維素濾膜過(guò)濾到錐形瓶中(注:緩沖液可保存10天有效)。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)液的制備

1)為了制備標(biāo)準(zhǔn)貯存液,將適量純?nèi)殍F蛋白的標(biāo)準(zhǔn)物溶于超純水中,制成蛋白濃度近似8.0mg/ml的溶液(按稱(chēng)的重量準(zhǔn)確計(jì)算其濃度);

2)用超純水將1ml標(biāo)準(zhǔn)貯存液稀釋成20ml(按稱(chēng)量質(zhì)量準(zhǔn)確計(jì)算其濃度);

3)為確定溶液的精確濃度,將過(guò)濾過(guò)的溶液在波長(zhǎng)280nm處測(cè)定其吸光度,按以下公式計(jì)算其濃度:

假定乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)液是10%的飽和溶液,按照E1%1cm=13.0,由280nm處的吸光度可確定其純度

純度=X/稀釋過(guò)的貯備液的濃度

標(biāo)準(zhǔn)貯存液的實(shí)際濃度等于稱(chēng)重計(jì)算出的濃度值乘以上面計(jì)算出的純度；

4)每次使用HPLC之前,都必須吸取1ml的標(biāo)準(zhǔn)液,用緩沖液A稀釋至0.2mg/ml,并經(jīng)過(guò)0.2μm乙酸纖維素濾膜過(guò)濾。

3.3 乳樣品的制備

①將乳樣品離心以除去乳脂肪(5分鐘);②將脫脂過(guò)的乳液用0.45μm乙酸纖維素濾膜過(guò)濾;③注入100μl(進(jìn)樣量100μl)。

4 分析條件

(1)梯度表:每個(gè)樣品分析的時(shí)間:17分鐘

(2)檢測(cè)皿的設(shè)定:波長(zhǎng)229nm,全標(biāo)尺吸光度單位0.200

(3)固定相:Hi Trap Heparin

5 計(jì)算和報(bào)告

乳鐵蛋白的濃度報(bào)告:通過(guò)注入不同體積(例如20μl,60μl,100μl,200μl)的乳鐵標(biāo)準(zhǔn)液,以吸收峰面積對(duì)(濃度×進(jìn)樣體積)畫(huà)圖,標(biāo)定曲線(xiàn)的斜率,Y軸截距和線(xiàn)性回歸可以計(jì)算出。

6 結(jié)語(yǔ)

總之,是一種具有多種生物學(xué)功能的蛋白質(zhì),母乳中同樣含有此成分,衛(wèi)生部也明確規(guī)定可用于嬰幼兒食品中。為確保乳鐵蛋白在食品中的添加量,迫切需要建立乳或乳制品中乳鐵蛋白的檢測(cè)方法,本方法回收率高,結(jié)果準(zhǔn)確,適用于乳或乳制品中乳鐵蛋白的檢測(cè)。

[1]Tatua生物學(xué)(1991)“用HPLC測(cè)定乳鐵蛋白的濃度”.

[2]夏明,應(yīng)鐵進(jìn).食品科學(xué)[J].2010年第2期.