陳菲云 張大偉 劉森

(1.三峽大學醫(yī)學院/分子生物學研究所 湖北宜昌 443002;2.中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所 天津 300308)

對三維結構及其功能之間的相互關系并不明確的酶進行改造,定向進化方法是很好的選擇。定向進化就是利用自然選擇的方法使工程蛋白能夠獲得天然蛋白不具備的特定性質的一種方法[1]。它不需要對蛋白結構與功能的關系有深刻的了解,它僅通過隨機突變或基因重組技術建立起突變體文庫,然后連接到表達載體導入宿主內進行蛋白表達,具有改進性狀的突變體被篩選出來再進行下一輪突變直至得到符合要求的突變體。文獻資料已有大量關于利用定向進化成功改變了分子的特異性和催化性能的例子[2]。

定向進化的步驟包括DNA突變庫的體外構建和DNA突變庫向宿主細胞的轉化。其中DNA突變庫的體外構建的常見方法已有不少文章總結過[3,4],本文選擇的是簡單高效的易錯PCR法。DNA突變庫向宿主細胞的轉化是至關重要的一步,因為庫容量的大小受轉化效率的限制,從而影響獲得好的突變體的機率。然而應用廣泛的表達宿主菌大腸桿菌雖背景清楚,生長繁殖快,易操作[5],是最常用的定向進化宿主菌。但其中作為蛋白表達常用的BL21(DE3)的轉化效率僅是DH5α的十分之一,不利于突變體庫的建立。綜上,高效的克隆轉化方法是定向進化方法所需求的。

做克隆最常用的是酶切連接法,是分子實驗常規(guī)的一種分子操作方法。但是在實際操作過程中,酶切連接法有一定的局限性,存在操作繁瑣,耗時長,且轉化率低,不適于建庫等需要大容量克隆的實驗。其它的克隆轉化的方法也已經(jīng)有很多種[6,7,8,9,10],我們選取了其中簡便高效的PCR法直接獲得多聚質粒的方法做突變體庫,與已有的常規(guī)方法比較。

通過比較兩種克隆轉化方法,分析兩種方法的應用效果。從而選擇高效的克隆轉化方法作為突變體庫構建方法,為下一步高通量篩選奠定良好的基礎,也為其他人做定向進化突變體庫提供了很好的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

質粒pET21a-lysozyme是本實驗室構建,pET21a載體為本實驗室自存。大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司。內切酶,T4連接酶及Q5超保真DNA聚合酶均為New England Biolabs公司產品。Agorose是Biowest的Regular agarose G-10。核酸電泳系統(tǒng)是北京六一儀器廠產品。Pcr儀購自東勝國際貿易有限公司。易錯pcr試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司。

1.2 常用的克隆轉化方法構建突變體庫

1.2.1 基于pcr的隨機突變

以質粒pET21a-lysozyme為模板,用易錯pcr法構建lysozyme序列的隨機突變庫,首先根據(jù)溶菌酶序列設計兩條引物,引物為表1中的Lysozyme F和Lysozyme R。為了得到突變體庫,易錯PCR的反應體系中添加了Mn2+離子,而且反應所用的四種dNTP不是等比例的,我們用的是即用型易錯PCR試劑盒,其各項試劑的比例是經(jīng)過優(yōu)化的。

50uL易錯pcr體系如下:5uL 10×易錯pcr緩沖液,5uL 10×易錯pcr專用dNTP,5uL MnCl2(5mM),1uL模板質粒pET21alysozyme(10 ng/uL),各1uL PCR引物F/R(10 uM),1uL TaqDNA聚合酶(5U/uL),ddH2O補至50 uL。

PCR擴增條件:94℃ 3min;94℃ 1min,60℃ 1min,72℃ 1 min,30個循環(huán);72℃ 10min。

易錯pcr擴增產物即為lysozyme序列的隨機突變庫。

1.2.2 突變文庫的構建

PCR產物經(jīng)瓊脂糖凝膠分離,膠回收純化后,限制性內切酶NdeI和XhoI分別對易錯PCR擴增產物和質粒pET21a-lysozyme進行酶切。酶切后的PCR產物純化,酶切后的載體經(jīng)瓊脂糖凝膠分離,切膠回收線性化載體片段,然后將酶切純化后的PCR產物和酶切膠回收的載體按照物質的量3:1以T4連接酶連接體系進行連接。

將連接產物轉化至大腸桿菌BL21(DE3)化學感受態(tài)細胞或將連接產物純化后,轉入大腸桿菌BL21(DE3)電轉化感受態(tài)細胞。涂布于LB(含100ug/uL的Amp)平板。37℃恒溫培養(yǎng)12h后,察看單菌落數(shù)量。

1.3 PCR產物直接轉化方法構建突變體庫

(1)此方法的引物設計及流程(圖1),首先仍然是以質粒pET21alysozyme為模板,用易錯pcr法構建lysozyme序列的隨機突變庫,引物為Table 1的P1,P2,去掉了酶切位點兩邊的保護堿基,以便于Overlap PCR的順利進行。

表1 文中所用引物匯總 (Table 1 Oligonucleotides used in this study.)

圖1 新方法構建突變體庫實驗流程P1,P2是易錯PCR引物;P3,P4是質粒線性化引物;lysozyme是我們突變體庫的目的序列,其它是質粒上的一些基本元件。Fig 1 The flow scheme of the two-step PCR procedure for the gene mutagenesis and plasmid multimerization.Lysozyme is the purpose sequence of our mutant library,others are the basic components of the plasmid.P1,P2,P3 and P4 denote the positions of the primers for the PCR amplication.

圖2 常規(guī)方法建立突變體庫過程中易錯PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖M是marker;1是易錯PCR產物Fig.2 Error-prone PCR products of the routine method.M:1Kb DNA marker;1:error-prone PCR products

圖3 兩種克隆轉化方法所得克隆數(shù)量比較1是常規(guī)方法做克隆轉化所得克隆數(shù)量,2是新方法所得的克隆數(shù)量Fig.3 The number of clones obtained by the two methods in Constructing Mutant Library in E.coli BL21(DE3).1:Result of transformation by routine method 2:Result of transformation by new method.

圖4 多聚PCR法直接轉化構建突變體庫的凝膠電泳圖M是marker;1是易錯PCR產物;2是線性化質粒PCR產物;3是overlap PCR 產物多聚化質粒;4是多聚質粒用NdeI和XhoI酶切后的產物Fig.4 Analysis of a 1%agarose gel for the PCR products of New method.M:marker;1:Error-prone PCR products of new method;2:PCR linearized vector;3:DNAmultimer generated by overlap extension PCR;4:Multimer digested with two restriction enzymes

PCR體系及擴增條件同1.2.1。

(2)通過PCR將質粒pET21a-lysozyme線性化。通過高保真PCR線性化質粒pET21a-lysozyme,引物設計時,要使線性化質粒包含要突變的溶菌酶的一部分序列,以便于下一步overlapPCR線性化質粒與易錯PCR序列有重疊區(qū),引物為表1中P3,P4。

50uLPCR反應體系如下:10uL 5×buffer,5uL 10×dNTP Mix,1uL模板質粒pET21a-lysozyme(10ng/uL),各1uL PCR引物F/R(10uM),0.5uL Q5超保真DNA聚合酶(2000U/uL),ddH2O補至50uL。

PCR擴增條件:98℃ 2min;98℃ 15 s,55℃ 30 s,72℃ 3min,30個循環(huán);72℃ 10min。

(3)通過Overlap PCR得到多聚化的重組質粒。線性化后的質粒和易錯pcr的產物均通過瓊脂糖凝膠電泳分離檢測,然后用凝膠回收試劑盒回收所需條帶,測定濃度。

Overlap PCR的反應體系:10uL 5×buffer,5uL 10×dNTP Mix易錯pcr產物(體系終濃度2ng/uL),線性化質粒(與易錯pcr產物等摩爾質量),0。5uL Q5超保真DNA聚合酶(2000U/uL),ddH2O補至50uL。

擴增條件:98℃ 3 min;98℃ 15 s,55℃ 30s,72℃ 5min,30個循環(huán);72℃ 10min。

(4)產物鑒定。將Overlap PCR得到的多聚化的重組質粒用醇沉法純化后,用限制性內切酶NdeI和XhoI酶切,以鑒定所得PCR產物是否是含有溶菌酶序列的pET21a質粒。

將通過Overlap PCR得到的多聚化的重組質粒10uL轉化至大腸桿菌BL21(DE3)化學感受態(tài)細胞,涂布于LB(含100ug/uL的Amp)平板。37℃恒溫培養(yǎng)12h后,察看單菌落數(shù)量。（表1）

2 結果

2.1 常規(guī)方法構建突變體庫

首先構建了重組質粒pET21a-lysozyme,重組質粒包含一段954bp的溶菌酶基因,以質粒pET21a-lysozyme為模板,在溶菌酶基因兩端設計引物以易錯pcr法得到lysozyme序列的隨機突變庫。經(jīng)瓊脂糖凝膠分離鑒定:在marker 1000bp靠下的位置得到一條明亮單一的條帶(圖2),由此可見易錯PCR產物為所需目的片段。

質粒酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠分離,將線性化載體片段切膠回收與PCR酶切后的片段連接后轉入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞。用此種方法做突變庫,無論是用化學轉化法還是轉化效率相對較高的電轉化法,得到的單菌落數(shù)量均不多,一再提高之前做連接所用的質粒線性片段與PCR酶切產物的量也不能解決問題。每個平板所得的單菌落數(shù)量始終在50以下(圖3中1)。

2.2 多聚PCR產物直接轉化法構建突變體庫

此方法仍然從質粒pET21a-lysozyme出發(fā),經(jīng)瓊脂糖凝膠鑒定仍可見明亮的與目的產物大小相符的條帶(圖4的1)。第二步引物設計在溶菌酶基因內部,這樣線性化質粒與溶菌酶基因兩邊均有100bp重疊序列。于是,線性化質粒的全長序列為5620bp,PCR完成后經(jīng)瓊脂糖凝膠鑒定,與目的片段大小相符(圖4的2)。將上兩步PCR所得產物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離并切膠回收目的片段后,測定所得的兩個目的片段濃度,然后按1:1比例做第三步的overlap PCR,此次PCR產物為多聚質粒,分子量過大,產物只是聚集在點樣孔內(圖4的3)。為了驗證所得產物為目的質粒,我們將overlap PCR的產物純化后用限制性內切酶NdeI和XhoI酶切,酶切產物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后可見明顯的兩條帶,其大小與我們的質粒pET21a和插入片段大小相符(圖4的4)。

將所得的Overlap PCR產物直接以化學轉化方法轉入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞,涂布在含有氨芐的固體平板上,長出的單菌落庫即為預期隨機突變體庫。用此種方法建突變體庫,效率很高,平均每個平板的單菌落數(shù)量均在200以上(圖3的2)。而且以此種方法做克隆,每管overlap PCR產物可轉化至少5個平板,單次產出高。

3 討論

在以BL21為宿主表達目的蛋白的過程當中,一般是將目的基因首先用不含有T7 RNA聚合酶基因的宿主菌進行克隆,比如DH5α。完成克隆后,將質粒轉入染色體上帶有l(wèi)ac UV 5調控的T7 RNA聚合酶基因的表達宿主菌中,用IPTG誘導表達目的蛋白。這樣一則是為了避免對宿主細胞有毒的蛋白產物影響質粒的穩(wěn)定性。一則是由于BL21的轉化效率低,僅是DH5α克隆型宿主菌的轉化效率的十分之一,不利于常規(guī)方法做克隆時連接產物的轉化。但是由于我們要建立基因突變庫,需要一步到位得到大量單克隆,先轉化DH5α再提質粒轉化BL21會降低建庫效率且增大后期篩選難度。而BL21的轉化效率又確實不利于大量突變體庫的獲得,于是我們需要改進克隆轉化方法。

文獻中介紹的PCR直接獲得多聚體的克隆轉化法在BL21中的轉化文章中已實驗過[10]。按照文獻中的實驗方法,結合我們的實驗需求,設計實驗流程如圖1所示,DNA突變庫的獲得僅需要三步PCR。

與常規(guī)克隆轉化方法相比,新方法步驟減少,操作簡單而且省時高效。常規(guī)方法構建突變體庫至少需要兩天時間,而新方法一天就可以完成。常規(guī)方法不僅步驟較多,耗時長,而且操作步驟多造成的DNA突變庫損失也大,最后轉化效率又很低,所以用常規(guī)方法做突變體庫太過困難,需要大量重復操作。新方法僅是三步PCR反應,省去了酶切再連接的繁瑣,不單節(jié)省時間而且避免了酶切連接過程中的產物損失,一輪實驗就可以得到大量突變子,是一種簡單實用且高效的突變體庫建立方法。

綜上,本文將常規(guī)克隆轉化方法與新方法建立突變體庫進行了比較,結果表明新方法在定向進化突變體庫的構建上具有較大優(yōu)勢,這種簡單高效實用的突變體庫構建方法值得借鑒。

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