響應面優(yōu)化減壓內部沸騰法提取辣椒堿工藝

柳昌武，陳曉光，韋藤幼*，童張法

(廣西大學化學化工學院，廣西石化資源加工及過程強化技術重點實驗室，廣西 南寧 530004)

辣椒堿(capsaicin)化學名為[(4-羥基-3-甲氧基苯基)-甲基]-8-甲基-(反)-6-壬烯酰胺，是辣椒中引起辛辣味的主要物質[1]。研究表明辣椒堿具有鎮(zhèn)痛、消炎、治療凍傷、止癢、殺菌、戒毒、祛風濕、殺蟲、催淚等[[2-5]藥理作用。目前對辣椒堿提取工藝的研究已有較多報道，主要有溶劑回流萃取法[6-10]、超聲波[11]及微波[12]輔助提取法、超臨界CO2流體萃取法[13-14]、酶法[15]，傳統(tǒng)的溶劑回流萃取法存在溶劑消耗大、提取得率低及雜質含量高等缺點，而其他的提取方法都需要昂貴的設備及較高的操作成本。

內部沸騰法[16-18]是一種能實現(xiàn)低溫快速的強化植物有效成分提取方法，它具有收率高、產品雜質少及容易實現(xiàn)等優(yōu)點，與其他提取工藝相比，該法在提取效率及提取質量方面具有優(yōu)越性[19-20]。然而，內部沸騰法提取工藝中影響提取得率的因素較多，一些因素交叉作用明顯，利用單因素來研究因素對提取過程的影響，往往得不到最優(yōu)的工藝條件[21]。本實驗以減壓內部沸騰法提取辣椒堿為研究對象，首先采用部分析因設計進行因素篩選，然后對選定的因素進行最陡爬坡試驗確定最優(yōu)點范圍，最后在最優(yōu)點范圍內進行響應面優(yōu)化，確定了減壓內部沸騰法提取最佳工藝條件，為實現(xiàn)辣椒堿的綠色提取提供技術借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮指天椒(產于廣西橫縣，乙醇回流法重復提取3次測定辣椒堿含量為0.271%)，50℃真空干燥后粉碎至80目；辣椒堿對照品(含量≥99%) 上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；D101大孔吸附樹脂 南開大學化工廠；乙醇(分析純) 廣東汕頭市西隴化工廠；甲醇(色譜純) 天津四友化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

CBM-10A vp島津-高效液相色譜儀(配有SPD-10AVP Plus紫外-可見檢測器和島津LC色譜工作站) 日本島津公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿易有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SZM 45-T2體視顯微鏡 寧波舜宇儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取工藝

減壓內部沸騰法：稱取10g辣椒粉，加入一定體積的較高體積分數(shù)乙醇溶液(解吸劑)均勻潤濕30min，使乙醇溶液充分浸潤辣椒物料；在一定溫度下，加入一定體積的較低體積分數(shù)乙醇溶液(提取劑)并迅速減壓，提取5min；過濾，取少量濾液，HPLC測定辣椒堿的含量，剩余濾液冰箱中低溫保存?zhèn)溆?。實驗裝置見圖1。

圖 1 實驗裝置圖Fig.1 Schematic diagram of vaccum innner ebullition extraciton

乙醇回流法：稱取10g辣椒粉，加入120mL質量體積分數(shù)為70%的乙醇溶液，加熱回流1h，過濾；取少量濾液，HPLC測定辣椒堿的含量，剩余濾液冰箱中低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 純化工藝

分別稱取10g(干質量約2g)D101大孔吸附樹脂，采用濕法裝入層析柱中。將減壓內部沸騰法及乙醇回流提取法制備的辣椒堿提取液減壓濃縮，濃縮物用蒸餾水稀釋至200mL，1mL/min上柱；上柱結束后，用50%乙醇洗至流出液無色，然后采用70%乙醇溶液洗脫至解吸液無辣味，收集70%乙醇解吸液，減壓濃縮并干燥；干燥物用甲醇溶解并定容至50mL，HPLC測定辣椒堿的含量。

1.3.3 顯微鏡掃描

取不同提取工藝的濾渣，50℃真空干燥、粉碎后，平鋪于載玻片上，用顯微鏡(放大20～30倍)進行放大掃描，記錄照片。

1.4 分析方法

1.4.1 色譜條件

色譜柱：C18Hypersil ODS色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：甲醇：0.1%磷酸＝65：35 (V/V)；檢測波長：λ＝280nm；流速：0.6mL/min；進樣量：20μL；柱溫：室溫。

1.4.2 繪制標準曲線

精確稱取真空干燥后的標準品辣椒堿2.30mg，溶解后轉移至250mL容量瓶中并用甲醇定容至刻度，制得9.11mg/L辣椒堿標準溶液。精密吸取1、5、10、15、20μL進樣，HPLC測定峰面積，以辣椒堿質量濃度X(mg/L)為橫坐標、峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線，得標準回歸方程：Y＝19065.6X－0.37594(R2＝0.9998)，線性范圍：0.46～9.11mg/L。

1.4.3 辣椒堿提取得率測定

辣椒堿提取得率按式(1)計算：

式中：y為辣椒堿提取得率/%；N為稀釋倍數(shù)；c為辣椒堿質量濃度/(mg/L)；V為提取液體積/mL；m為辣椒粉質量/g。

1.5 提取工藝條件的優(yōu)化

1.5.1 因素篩選試驗

減壓內部沸騰提取過程分兩步，第一步的解吸劑(乙醇)體積分數(shù)(X1)和解吸劑用量(X2)和第二步的提取劑(低體積分數(shù)乙醇)體積分數(shù)(X3)、提取劑用量(X4)以及提取溫度(X5)等因素對減壓內部沸騰提取過程有影響，但那些因素影響大需確定。采用2Ⅴ5-1析因設計對X1～X5這5個因素進行篩選。因素水平編碼及試驗方案見表1。

1.5.2 最陡爬坡試驗

響應面法優(yōu)化必須在最優(yōu)點的附近區(qū)域模擬真實情形，遠離最優(yōu)點區(qū)域擬合的模型可靠性低[14]。為了獲得最佳的提取條件范圍，本實驗采用最陡爬坡試驗對影響較大條件進行逼近。具體步驟如下：首先，對2Ⅴ5–1析因設計的結果進行一階模型擬合，如式(2)所示，篩選出影響較大因素；其次，取│βj│最大時對應的變量Xj的步長為Δxj，按式(3)計算其他變量的步長；將Δxi按式(4)轉換成自然變量步長Δξi。取各顯著因素的0水平為原點，以βi的符號正負為爬坡方向設計爬坡試驗。試驗方案見表2。

式中：y為提取得率；β0、βi為歸系數(shù)；Xi為試驗因素。

式中：Xi(1)、Xi(–1)分別為i因素的低水平與高水平。

1.5.3 響應面優(yōu)化

以最陡爬坡試驗中提取得率最高的試驗條件作為中心點，進行中心復合設計，共20個試驗點：前14個試驗點為析因點，即自變量取值在X1、X2、X3所構成的三維頂點；后6個試驗點為區(qū)域的中心點，重復6次用以估計試驗誤差。因素水平編碼和實驗設計表見表3。

運用Design-Export 7.0軟件對試驗結果數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合得回歸模型見式(5)，對回歸模型進行分析并計算辣椒堿的最大提取得率及相應的最優(yōu)提取工藝條件，最后對最優(yōu)提取工藝進行驗證實驗。

式中：y為提取得率；β0、βi、βii、βij為歸系數(shù)；Xi為試驗因素。

2 結果與分析

2.1 因素篩選試驗

表 1 2V5–1析因設計試驗因素水平及結果Table 1 Experimental arrangements and results of 2V5–1 factorial design

通常而言，因素影響的顯著性可以由回歸t檢驗的P值大小來判定。表1數(shù)據(jù)的回歸分析見式(6)，t檢驗可知因素X4(P4＝0.0666)及X5(P5＝0.2192)對響應值的影響不顯著(P＞0.05)，確定提取用量為12mL/g，提取溫度為50℃，而因素X1、X2及X3對響應值的影響高度顯著，需對它們進行最陡爬坡試驗。

2.2 最陡爬坡試驗

最陡爬坡試驗方案與結果如表2所示。不難看出，提取得率最高的條件在第2組與第4組試驗之間，第3組試驗的提取得率最高，所以選取第3組試驗條件為響應面優(yōu)化的中心點，并以第2組與第4組試驗條件為邊界條件，進行中心復合設計。

表 2 最陡爬坡試驗設計與結果Table 2 Experimental design and results of the steepest ascent experiment

2.3 響應面優(yōu)化試驗

表 3 中心復合試驗設計及其結果Table 3 Experimental design and results of the central composite design experiments

表3給出了提取工藝的中心復合設計及試驗結果，采用式(5)的模型對表3的數(shù)據(jù)進行次初步回歸見式(7)，對回歸進行t檢驗發(fā)現(xiàn)，X1X2、X1X3和X12的影響不顯著(P＞0.05)，去掉這3項的回歸結果見式(8)。

由式(8)知：①X1、X2、X3的系數(shù)大小順序為β1＜ β2＜β3，所以，X1、X2、X3對響應值影響顯著性大小為：提取劑體積分數(shù)＞解吸劑用量＞解吸劑體積分數(shù)。②X2和X3具有交互作用，圖2給出了X2、X3因素間交互作用對辣椒堿提取得率的影響，由圖可知X2、X3的交互作用對辣椒堿的提取得率影響存在最大值。

通過對式(8)進行最優(yōu)化計算得：最高提取得率y＝0.212%，此時：X1＝－0.945、X2＝1.601、X3＝0.624；對應最佳工藝條件：解吸劑乙醇體積分數(shù)為82%，解吸劑用量為3.5mL/g物料，提取劑乙醇體積分數(shù)44%。按照最佳工藝條件，進行3次驗證實驗，其提取得率分別為0.213%、0.211%、0.208%，平均提取得率為0.211%(σ＝0.0025)，與預測值基本一致，說明回歸模型可靠。

圖 2 解吸劑用量與提取劑乙醇體積分數(shù)因素間交互作用對提取得率影響的響應曲面圖與等高線圖Fig.2 Response surfaces and contour plot of the interaction between each factors on the yield of capsaicin

2.4 辣椒堿的減壓內部沸騰法提取與乙醇回流法提取的對比

對優(yōu)化后的減壓內部沸騰法提取液和乙醇回流法提取液用D101大孔吸附樹脂進行純化，純化結果及主要工藝參數(shù)的對比見表4。由表可知，雖然減壓內部沸騰法的提取得率比乙醇回流法提高不多(一次提取辣椒堿提取率為77.9%)，但提取時間、溫度、乙醇用量以及純化后的過柱浸膏收率與純度都有明顯優(yōu)勢，特別是提取液過柱收率提高了15.8%及浸膏純度提高了5.0%，這是因為減壓內部沸騰法提取溫度低、乙醇體積分數(shù)低以及時間短，辣椒的色素等雜質提出少，對大孔吸附樹脂的污染較輕，這樣提高了純化的分離效果。圖3所示的提取前辣椒粉及兩種方法提取后辣椒殘渣的顯微照片也同樣說明了這個問題，減壓內部沸騰法提取后的辣椒殘渣與提取前的辣椒粉形貌與顏色差別不大，而傳統(tǒng)回流法的提取殘渣色澤加深、腐爛結團，顆粒膨脹及溶化較嚴重。所以減壓內部沸騰法提取的辣椒粉殘渣經烘干、粉碎等簡單處理即可以作為低辣度的辣椒粉應用于食品調料、飼料添加劑以及作為制備微辣辣椒油的原料。

表 4 減壓內部沸騰法與乙醇回流法對辣椒堿的提取及純化工藝的比較Table 4 Comparison between the tradition ethanol refluxing extraction and the inner ebullition extraction

圖 3 原辣椒粉與提取殘渣的對比Fig.3 Comparison between cayenne peppers before and after extraction

3 結 論

減壓內部沸騰提取法的主要影響因素為解吸劑體積分數(shù)、解吸劑用量、提取劑體積分數(shù)，辣椒堿的減壓內部沸騰法提取工藝最佳條件為解吸劑乙醇體積分數(shù)82%、解吸劑用量3.5mL/g、提取劑乙醇體積分數(shù)44%、提取劑用量12mL/g，此條件下50℃提取5min，辣椒堿的提取得率為0.211%。

與乙醇回流法的對比表明，減壓內部沸騰法具有提取時間短、溫度低及提取質量好等優(yōu)越性，提取后的殘渣與提取前的外觀差別不大，可以作為制備微辣辣椒食品的原料。

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