脂肪酶活力測(cè)定方法及其在篩選產(chǎn)脂肪酶微生物中的應(yīng)用

王歡 何臘平 周換景 張義明 李翠芹 陶菡

（1.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025；2.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴陽 550025；3.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025；4.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025）

脂肪酶（甘油三酯水解酶，EC 3.1.1.3）是由動(dòng)植物及微生物產(chǎn)生的能在水-油界面催化甘油三酯水解的酶，而且在非水相介質(zhì)中可催化酯合成反應(yīng)。其中，微生物脂肪酶由于其穩(wěn)定性、選擇性及底物特異性在商業(yè)應(yīng)用方面顯示出巨大的潛能［1，2］，所以有效篩選產(chǎn)脂肪酶微生物具有重要意義。

微生物篩選的關(guān)鍵問題是如何構(gòu)建高效篩選模型，而在篩選合適的生物催化劑之前要測(cè)定其活力大小。目前關(guān)于脂肪酶活力的測(cè)定，常用的實(shí)用方法主要有：測(cè)其水解酶活力的方法，如平板法［3］、橄欖油乳化法［4，5］、對(duì)硝基苯酚法［6-8］等；測(cè)其酯合成酶活力的，如對(duì)硝基苯酚法測(cè)脂肪酶酯合成酶活力［9］等。因?yàn)闇y(cè)定方法的選擇是否合適直接關(guān)系到有效篩選到產(chǎn)脂肪酶的微生物的可能性，所以本研究旨在探討篩選產(chǎn)脂肪酶微生物的最佳方法。

基于此，本研究就目前常用的羅丹明平板法，橄欖油乳化法，對(duì)硝基苯酚法測(cè)脂肪酶水解酶活以及對(duì)硝基苯酚法測(cè)脂肪酶酯合成酶活幾種脂肪酶活力測(cè)定方法進(jìn)行了比較試驗(yàn)，并對(duì)其在篩選產(chǎn)脂肪酶微生物中的相應(yīng)應(yīng)用進(jìn)行了探討，以期更好地服務(wù)于實(shí)踐應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

Novozyme 435（諾維信脂肪酶）由 Novo Nordisk，Bagsvard，Denmark贈(zèng)送。脂肪酶lipase AY由Amano酶制劑公司贈(zèng)送，脂肪酶PPL（Pocine Pancreas Lipas）由Sigma-Aldrich Chemical Co.購買。本試驗(yàn)所用微生物來自于貴州大學(xué)貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。對(duì)硝基苯酚（ρ-NP）和4-硝基苯基棕櫚酸酯（ρ-NPP）標(biāo)樣自百靈威科技有限公司購買。其他試劑均為分析純或者商業(yè)用途。

1.2 方法

1.2.1 脂肪酶活力測(cè)定法 羅丹明平板法判斷原理：羅丹明B能與脂肪酶水解的各種可能的底物（單、二油酸甘油酯，油酸，油酸鈉）結(jié)合為聚合體，該聚合體受紫外光激活，產(chǎn)生橘黃色熒光［10］。依據(jù)有無橘黃色、顏色深淺和水解圈大小來判斷是否產(chǎn)脂肪酶和對(duì)所產(chǎn)脂肪酶活力大小進(jìn)行初步判斷。

羅丹明平板法參考文獻(xiàn)［3］。橄欖油乳化法參考文獻(xiàn)［4，5］。對(duì)硝基苯酚法測(cè)脂肪酶水解酶活力法參考文獻(xiàn)［6-8］。對(duì)硝基苯酚法測(cè)脂肪酶酯合成酶活力法參考文獻(xiàn)［9］。

1.2.2 產(chǎn)高水解脂肪酶活力的微生物篩選中的脂肪酶活力測(cè)定方法

1.2.2.1 粗酶液及粗酶粉的制備 種子培養(yǎng)基（%）：牛肉膏0.3，蛋白胨0.5，葡萄糖0.5，NaCl 0.5，pH8.5，15 mL/250 mL三角瓶。發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基（%）：豆餅粉2.0，玉米漿 2.0，可溶性淀粉 1.0，K2HPO40.5，NaNO30.5，pH7.0，50 mL/250 mL三角瓶。

挑取一環(huán)新鮮的斜面種子，接入液體種子培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h。然后取2 mL液體種子于發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)72 h。將發(fā)酵液于4℃，8 000 r/min離心，上清液測(cè)酶活，沉淀經(jīng)緩沖液洗滌后離心收集經(jīng)冷凍干燥即為粗酶粉。

1.2.2.2 酶活測(cè)定 對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的產(chǎn)脂肪酶菌種進(jìn)行酶活測(cè)定，定性測(cè)定采用平板法，定量測(cè)定采用橄欖油乳化法和對(duì)硝基苯酚法測(cè)脂肪酶水解酶活。

1.2.3 產(chǎn)高酯合成酶活力的微生物篩選中的脂肪酶活力測(cè)定方法 粗酶液及粗酶粉的制備方法同

1.2.2.1。酶活測(cè)定：產(chǎn)水解脂肪酶活力高的菌株，需進(jìn)行水解酶活力測(cè)定。篩選一般要進(jìn)行初篩和復(fù)篩。初篩要注重?cái)?shù)量，要有簡(jiǎn)單明了的判斷方法，羅丹明平板法正符合要求；復(fù)篩要注重質(zhì)量，要進(jìn)行酶活力大小的測(cè)定，則需選用相應(yīng)的定量測(cè)定方法。對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的產(chǎn)脂肪酶菌種進(jìn)行酶活測(cè)定，定性測(cè)定采用平板法，定量測(cè)定采用對(duì)硝基苯酚法測(cè)脂肪酶酯合成酶活。

2 結(jié)果

2.1 羅丹明平板法

將幾株微生物接入羅丹明B培養(yǎng)平板中，于365 nm紫外燈下觀察。結(jié)果如圖1所示，有些菌落有橘黃色光，有些無，表明產(chǎn)橘黃色光的菌落產(chǎn)脂肪酶，否則不產(chǎn)脂肪酶或產(chǎn)脂肪酶活力可忽略。

由于羅丹明平板法簡(jiǎn)便易行，適用于初篩時(shí)對(duì)所篩選的微生物是否產(chǎn)脂肪酶做定性和初步定量判斷，將用于后續(xù)篩選。

2.2 橄欖油乳化法

2.2.1 橄欖油乳化法與pH對(duì)應(yīng)關(guān)系 用橄欖油乳化法測(cè)定不同pH值的脂肪酶活力，脂肪酶相對(duì)活力與pH對(duì)應(yīng)關(guān)系如圖2所示。結(jié)果表明，采用橄欖油乳化法測(cè)定脂肪酶活力，pH有較大影響，且不同脂肪酶的最適pH不同。

2.2.2 橄欖油乳化法測(cè)定精密度 采用橄欖油乳化法測(cè)定脂肪酶酶活力，結(jié)果見表1。

由表1可知，橄欖油乳化法所測(cè)結(jié)果變化較大，精確性和穩(wěn)定性差。從誤差來源分析，其指示劑終點(diǎn)變色范圍大、不明顯造成該方法穩(wěn)定性差［11］。

2.3 對(duì)硝基苯酚法測(cè)脂肪酶水解酶活

對(duì)硝基苯酚法測(cè)脂肪酶水解酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）顯示，對(duì)硝基苯酚含量（x）為0-100 μmol/L時(shí)與吸光度（y）值呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，回歸方程為：y=0.17678x+0.00983，相關(guān)系數(shù)R2=0.99938。該圖的試驗(yàn)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差≤0.37%。

表1 橄欖油乳化法測(cè)得脂肪酶酶活及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

采用對(duì)硝基苯酚法測(cè)定脂肪酶水解酶活力，結(jié)果見表2。由表2可知，當(dāng)酶活數(shù)值比較大時(shí)，精確度和穩(wěn)定性比較高，但總體均優(yōu)于橄欖油乳化法。

2.4 對(duì)硝基苯酚法測(cè)脂肪酶酯合成酶活

對(duì)硝基苯酚法測(cè)脂肪酶酯合成酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4）顯示，對(duì)硝基苯酚含量（x）為-2 mmol/L時(shí)與吸光度（y）值呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，回歸方程為：y=6.12562x+0.01334，相關(guān)系數(shù)R2=0.99970。該圖的試驗(yàn)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差≤0.42%。

采用對(duì)硝基苯酚法測(cè)定脂肪酶酯合成酶活力，結(jié)果（表3）顯示，當(dāng)酶活的數(shù)值過大或過小時(shí)均影響測(cè)定的穩(wěn)定性。

表2 對(duì)硝基苯酚法測(cè)脂肪酶水解酶活及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

表3 對(duì)硝基苯酚法測(cè)脂肪酶酯合成酶活及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.5 脂肪酶活力測(cè)定方法在產(chǎn)水解脂肪酶活力的微生物篩選的應(yīng)用結(jié)果

2.5.1 初篩中的羅丹明平板法檢測(cè)結(jié)果 從實(shí)驗(yàn)室保藏菌種中，利用羅丹明平板法篩選出了50株產(chǎn)脂肪酶微生物（其中部分是前期試驗(yàn)篩選出來保藏的），將具有變色圈的菌種挑出進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.5.2 復(fù)篩中的對(duì)硝基苯酚法測(cè)脂肪酶水解酶活檢測(cè)結(jié)果 由于對(duì)硝基苯酚法比橄欖油乳化法測(cè)定脂肪酶水解酶活相對(duì)偏差要小，所以在復(fù)篩中選擇對(duì)硝基苯酚法測(cè)定脂肪酶水解酶活。

粗酶粉采用對(duì)硝基苯酚法測(cè)脂肪酶水解酶活。測(cè)定結(jié)果（表4）表明，酶活高的菌株較少，其中酶活最高的菌株可達(dá)3.921 U/mL。上述結(jié)果說明可以通過羅丹明平板法初篩和對(duì)硝基苯酚法測(cè)脂肪酶水解酶活法篩選到水解酶活較高的產(chǎn)脂肪酶菌株。

表4 對(duì)硝基苯酚法測(cè)定水解酶活

2.6 脂肪酶活力測(cè)定方法在產(chǎn)高酯合成脂肪酶活力的微生物篩選的應(yīng)用結(jié)果

初篩中的羅丹明平板法檢測(cè)結(jié)果 同2.5.1。復(fù)篩中粗酶粉采用對(duì)硝基苯酚法測(cè)脂肪酶酯合成酶活，測(cè)定結(jié)果如表5所示，其中酶活最高的菌株為3.296 U/g。上述結(jié)果說明可以通過羅丹明平板法初篩和對(duì)硝基苯酚法測(cè)脂肪酶合成酶活法篩選到酯合成酶活較高的產(chǎn)脂肪酶菌株。

表5 對(duì)硝基苯酚法測(cè)定合成酶活

3 討論

對(duì)上述測(cè)定方法進(jìn)行比較，由于羅丹明平板法只適合于對(duì)脂肪酶做定性和初步定量判斷，在這里比較上述后面3個(gè)定量檢測(cè)方法。

3.1 精密度比較

總體來講，對(duì)硝基苯酚法要比橄欖油乳化法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差要小，重現(xiàn)性好。但是對(duì)于酶活較小的菌種，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，所以選擇正確的酶活測(cè)定方法很重要。

3.2 酶活力大小比較

3種方法測(cè)得幾種脂肪酶的酶活及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差顯示（橄欖油乳化法測(cè)定酶活時(shí)采用每種脂肪酶的最適pH值），3種測(cè)定方法在測(cè)定同一種脂肪酶時(shí)，測(cè)定結(jié)果在數(shù)值上有一定的差異，不能互相代替。橄欖油乳化法和對(duì)硝基苯酚法測(cè)定脂肪酶水解酶活時(shí)數(shù)據(jù)相差較大，其中對(duì)硝基苯酚法穩(wěn)定性較好，尤其在測(cè)定有較大酶活的脂肪酶時(shí)。因此，在測(cè)定脂肪酶活力前，確定合適的稀釋倍數(shù)尤為重要。

所測(cè)出酶活與脂肪酶所催化的反應(yīng)有對(duì)應(yīng)關(guān)系，Lipase AY主要催化甘油三酯的水解，Novozym 435主要催化酯合成反應(yīng)，故Lipase AY的水解酶活最高，而Novozym 435的酯合成酶活最高。

3.3 水解酶活力及合成酶活力相關(guān)性比較

表3與表1、表2比較可知，脂肪酶的酯合成酶活力與水解酶活力一般并不一致，與文獻(xiàn)［12，13］的報(bào)道一致。由此得出結(jié)論，如果目的是篩選脂肪酶水解酶活力高的菌株，就要用脂肪酶水解酶活測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定；反之，就要用脂肪酶酯合成酶活測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。

今后的脂肪酶篩選可基于這一思路進(jìn)行，對(duì)于這種選擇測(cè)定方法的可行性再進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié)論

（1）平板法快速、簡(jiǎn)單，適用于產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選，但是精確度不足，并且需要的時(shí)間周期比較長(zhǎng)。

（2）橄欖油乳化法方法簡(jiǎn)便、測(cè)定速度較快，但是重現(xiàn)性較差，可用于粗略的估計(jì)酶活大小。

（3）與橄欖油乳化法相比，對(duì)硝基苯酚法測(cè)水解酶活靈敏度有所提高，方法穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，有利于檢測(cè)活力低的脂肪酶，是構(gòu)建脂肪酶高通量模型的較好選擇。

（4）對(duì)硝基苯酚法測(cè)合成酶活方法能比較好的衡量脂肪酶的合成能力，是篩選具有合成能力的脂肪酶的比較好的方法。

（5）脂肪酶的水解酶活和合成酶活力往往不一致，所以實(shí)際應(yīng)用時(shí)應(yīng)選用相應(yīng)的測(cè)定方法。本研究也基于這一原則，分別成功地篩選到了脂肪酶水解酶活較高的菌株和脂肪酶合成酶活較高的菌株。

［1］ Cardenas F，de Castro MS，Sanchez-Montero JM，et al. Novel microbial lipase：catalytic activity in reactions in organic media［J］. Enzyme and Microbial Technology，2001，28（2-3）：145-154.

［2］ Kretza E，Papaneophytou CP，Papi RM，et al. Lipase activity in Thermus thermophilus HB8：Purification and characterization of the extracellular enzyme［J］. Biotechnology and Bioprocess Engineering，2012，17：512-525.

［3］ Kouker G，Jaeger KE. Specific and sensitive plate assay for bacterial lipases. Appl Environ Microbiol，1987，53（1）：211-213.

［4］ 周曉云.酶技術(shù)［M］.北京：石油工業(yè)出版社，1995：287-291.

［5］ 高修功.微生物脂肪酶生產(chǎn)及非水相催化性質(zhì)與應(yīng)用的研究［D］.浙江：無錫輕工大學(xué)，1995：28-29.

［6］ 鄭小梅.脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及其脂肪酶基因的克?。跠］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2009：23-24.

［7］ 江慧芳，王雅琴，劉春國(guó).三種脂肪酶活力測(cè)定方法的比較與改進(jìn)［J］.化學(xué)與生物工程，2007，24（8）：72-75.

［8］ Margesin R，F(xiàn)eller G，Hammerle M，et al. A colorimetric method for the determination of lipase activity in soil［J］. Biotechnology Letters，2002，24：27-33.

［9］ 滕云.酯合成脂肪酶高產(chǎn)菌的選育及其產(chǎn)酶發(fā)酵調(diào)控的研究［D］.浙江：江南大學(xué)，2008：18-19.

［10］ 謝紅想.有機(jī)相中芳香酯合成用脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及其應(yīng)用［D］.浙江：無錫輕工業(yè)大學(xué)，1998.

［11］ 劉虹蕾，繆銘，江波，等.微生物脂肪酶的研究與應(yīng)用［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（12）：376-381.

［12］ Goujard L，Villeneuve P，Barea B，et al. A spectrophotometric transesterification-based assay for lipase in organic solvent［J］. Analytical Biochemistry，2009，385：161-167.

［13］ Wu XY，Jaaskelainen S，Linko YY. An investigation of crude lipases for hydrolysis，esterification，and transesterification［J］. Enzyme and Microbial Technology，1996，19（3）：226-231.