張 獻(xiàn),彭 濤,張 耀,李若熙,楊麗娟

(釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(四川輕化工大學(xué))，四川 宜賓 644000)

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate 或Urethane，簡(jiǎn)稱EC)，存在于多種發(fā)酵食品和酒精飲料中，是一種具有致癌性的物質(zhì)[1-2]。2007年，EC被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)IARC(the International Agency for Rescarch on Cancer)歸類為2A類致癌物質(zhì)[3]。日本、加拿大等[4-5]國家對(duì)酒精飲料中EC含量有著嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)。目前消除EC有多種方法，包括對(duì)發(fā)酵工藝的優(yōu)化、物理吸附、代謝工程改造酵母以及生物酶法消除等，其中用生物酶法來消除EC被認(rèn)為是最為理想的一種方法[6]。關(guān)于消除EC的生物酶研究中，用于EC消除的酶有兩種，一種是酸性脲酶(Acid urease)；另外一種就是氨基甲酸乙酯水解酶(Urethane hydrolase或urethanase)。1990年，Kobashi[7]等日本學(xué)者從小鼠腸道中的Citrobactersp.中第一次發(fā)現(xiàn)EC水解酶，證實(shí)其能夠降解EC。2006年，Akutsu-ShigenoY[8]等從馬紅球菌(RhodococcusequistrainTB-60)中得到了EC水解酶，并實(shí)現(xiàn)了該酶的異源表達(dá)。李京京[9]等從小鼠的胃中篩選出一株具有EC降解能力的賴氨酸芽孢桿菌LysinibacillusfusiformisSC02，并通過對(duì)其蛋白質(zhì)的N段測(cè)序，獲得了該酶的氨基酸序列。EC水解酶存在于多種微生物中，并且不同微生物的EC水解酶的酶學(xué)性質(zhì)差異較大，普遍存在對(duì)乙醇和酸的耐受力差、對(duì)底物的親和力低的問題[8, 10]。2016年，劉曉慧[11]等人通過計(jì)算機(jī)輔助以及定向改造技術(shù)對(duì)來自于賴氨酸芽孢桿菌LysinibacillusfusiformisSC02的EC水解酶進(jìn)行改造，提高了該酶的溫度穩(wěn)定性，但其對(duì)乙醇的耐受力并未有所提升。此外，EC水解酶的氨基酸序列未得到有效解析。2019年，Masaki[12]等日本學(xué)者在假絲酵母Candidaparapsilosis得到了EC水解酶，并獲得了該酶的基因序列。目前，已報(bào)道的EC水解酶均屬于酰胺酶家族，從EC分子的結(jié)構(gòu)上來看，酯酶家族部分酶也能夠?qū)ζ溥M(jìn)行水解，但是還未見有酯酶降解EC的報(bào)道[6](見圖1)。EC水解酶存在的這些問題限制了EC水解酶的發(fā)展與應(yīng)用。若采用基因工程以及蛋白質(zhì)工程的手段，對(duì)EC水解酶進(jìn)行分析優(yōu)化等研究，解決其存在的問題，可進(jìn)一步推進(jìn)EC水解酶在食品中的應(yīng)用。

圖1 氨基甲酸乙酯水解機(jī)制[6]Fig.1 Hydrolysis mechanism of urethane[6]

本研究采用生物信息學(xué)的方法對(duì)EC水解酶進(jìn)行分析，結(jié)合ProtParam、ProtScale、SignalP 5.0 Server、NetPhos 2.0 Server等生物信息學(xué)軟件，對(duì)微生物的EC水解酶氨基酸序列分別進(jìn)行理化性質(zhì)、序列分子進(jìn)化、親水或疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、功能域、信號(hào)肽以及蛋白的磷酸化等方面進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，為下一步EC水解酶的酶分子改造、基因工程菌的構(gòu)建、表達(dá)等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

試驗(yàn)中的EC水解酶(UH)序列均來自美國國家生物信息中心(NCBI)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中已收錄的完整的氨基酸序列，分別來自于馬紅球菌、賴氨酸芽孢桿菌以及假絲酵母(見表1)。

表1 氨基酸序列基本信息Table 1 Basic information of amino acid sequence

1.2 方法

采用Expasy網(wǎng)站提供的ProtParam工具對(duì)EC水解酶的氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析；親疏水性特征使用Expasy網(wǎng)站的ProtScale工具進(jìn)行分析；使用在線工具NPSA server中的SOPMA進(jìn)行微EC水解酶的氨基酸序列二級(jí)結(jié)構(gòu)分析和預(yù)測(cè)[13]；使用CDD和SMART[14]對(duì)EC水解酶保守結(jié)構(gòu)的分析；EC水解酶信號(hào)肽的分析和預(yù)測(cè)采用工具SignalP 5.0 server；運(yùn)用TMHMM 2.0 Server進(jìn)行EC水解酶的跨膜結(jié)構(gòu)域的分析和預(yù)測(cè)；NetPhosK 3.1 Server進(jìn)行EC水解酶的氨基酸序列磷酸化位點(diǎn)分析；使用SWISS-MODEL[15]和I-TASSER對(duì)EC水解酶進(jìn)行3D建模，以及使用SAVES[16]對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。利用Clustal Omega[17]進(jìn)行氨基酸的多序列比對(duì)分析，并用ESPript3.0進(jìn)行序列對(duì)比的結(jié)果顯示。在線分析工具網(wǎng)址(見表2)。

表2 生物學(xué)在線分析工具網(wǎng)址Table 2 Websites of online biology analysis tools

2 結(jié)果與分析

2.1 EC水解酶蛋白序列理化性質(zhì)分析

使用ProtParam工具分析3條完整的EC水解酶蛋白序列(見表3)。結(jié)果顯示，目前在NCBI上所能檢索到的EC水解酶氨基酸序列中，氨基酸數(shù)量在472-551之間，氨基酸數(shù)量最大的是假絲酵母，為551 aa，分子量為61.74 kDa左右。理論等電點(diǎn)(pI)范圍在5.03～5.71之間，最大的為Candidaparapsilosis。三個(gè)蛋白的負(fù)電荷氨基酸殘基總數(shù)(Asp + Glu)都大于正電荷氨基酸殘基總數(shù)(Arg + Lys)。同時(shí)對(duì)三個(gè)EC水解酶的氨基酸殘基組成也進(jìn)行了分析(見表4)。發(fā)現(xiàn)3個(gè)EC水解酶蛋白共有的且含量豐富的主要氨基酸為丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、亮氨酸(Leu)。在蛋白質(zhì)穩(wěn)定性方面，RhodococcusequistrainTB-60的EC水解酶不穩(wěn)定指數(shù)為34.70，顯示為較穩(wěn)定蛋白，其余兩種蛋白為不穩(wěn)定蛋白。此外，脂肪系數(shù)的結(jié)果顯示，3個(gè)蛋白均表現(xiàn)為親水性。

表3 EC水解酶的氨基酸序列理化性質(zhì)Table 3 Physicochemical properties of amino acid sequence of urethane hydrolase

表4 EC水解酶家族成員氨基酸組成成分分析Table 4 Analysis of amino acid composition of members of urethane hydrolase family %

2.2 EC水解酶氨基酸序列的親水性/疏水性

經(jīng)過ProtScale對(duì)EC水解酶氨基酸序列進(jìn)行親水性/疏水性預(yù)測(cè)。Hphob. /Kyte & Doolittle量表規(guī)定疏水性越強(qiáng)的氨基酸標(biāo)度值越高，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的氨基酸標(biāo)度值大于0時(shí)為疏水，小于0時(shí)為親水。

在親疏性分析中，馬紅球菌RhodococcusequistrainTB-60的多肽鏈中465位Trp的值為-2.156，親水性最強(qiáng)，第283位Cys的值為2.089，疏水性最強(qiáng)(見圖2a)；賴氨酸芽孢桿菌LysinibacillusfusiformisSC02的多肽鏈中第463位Asn的值是-3.344，是最低分，親水性最強(qiáng)，第229位Leu值是1.978，為最高分，疏水性最強(qiáng)(見圖2b)；假絲酵母Candidaparapsilosis的多肽鏈中第324位Pro的值為-3.244，親水性最強(qiáng)，第453位Val的值為2.156，疏水性最強(qiáng)(見圖2c)；且在親疏水性分析中三種微生物的EC水解酶都屬于親水性蛋白。

2.3 EC水解酶的信號(hào)肽及跨膜區(qū)預(yù)測(cè)

利用SignalP 5.0 server對(duì)三株菌的EC水解酶的氨基酸序列進(jìn)行信號(hào)肽分析，都表示EC水解酶的氨基酸序列不含有信號(hào)肽(見圖3)。

利用在線工具TMHMM 2.0 Server對(duì)三株菌的EC水解酶的跨膜區(qū)進(jìn)行分析及預(yù)測(cè)，3株菌的EC水解酶在膜內(nèi)的概率為0，在膜外的概率為100%(見圖4)，說明EC水解酶不存在跨膜結(jié)構(gòu)域。

2.4 EC水解酶的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

磷酸化作為蛋白質(zhì)翻譯后的修飾之一，在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的作用[18]。蛋白質(zhì)的磷酸化主要集中在肽鏈中具有游離羥基的酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸殘基上，這些殘基本身不帶電荷，當(dāng)磷酸化作用后，便具有了電荷，從而使結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)一步引起蛋白質(zhì)活性的變化。通過在線軟件NetPhosK 3.1 Server對(duì)EC水解酶的氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)。EC水解酶氨基酸序列磷酸化位點(diǎn)(見表5)。RhodococcusequistrainTB-60的EC水解酶中含有15個(gè)絲氨酸位點(diǎn)、10個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)、6個(gè)酪氨酸位點(diǎn)；LysinibacillusfusiformisSC02的EC水解酶中含有23個(gè)絲氨酸位點(diǎn)、11個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)、7個(gè)酪氨酸位點(diǎn)；Candidaparapsilosis的EC水解酶中含有30個(gè)絲氨酸位點(diǎn)、16個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)、12個(gè)酪氨酸位點(diǎn)。

表5 EC水解酶氨基酸序列磷酸化位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)Table 5 Statistics of phosphorylation sites of amino acid sequence of urethane hydrolase

2.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)一般由α-螺旋、β-鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等結(jié)構(gòu)原件組成[19]。通過SOPMA在線工具對(duì)3株菌的EC水解酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果(見圖5)。RhodococcusequistrainTB-60的EC水解酶中α-螺旋占41.53%，延伸鏈占7.63%，β-轉(zhuǎn)角占3.39%，無規(guī)則卷曲占47.46%；LysinibacillusfusiformisSC02的EC水解酶中α-螺旋占48.09%，延伸鏈占10.59%，β-轉(zhuǎn)角占3.6%，無規(guī)則卷曲占37.71%；Candidaparapsilosis的EC水解酶中α-螺旋占39.34%，延伸鏈占11.07%，β-轉(zhuǎn)角占3.45%，無規(guī)則卷曲占46.10%。

2.6 保守結(jié)構(gòu)域分析

通過CDD和SMART對(duì)EC水解酶的保守結(jié)構(gòu)域分析得出，來自于三種不同菌的EC水解酶都含有與酰胺酶家族相同的Amidase結(jié)構(gòu)域(見圖6)。

2.7 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)與評(píng)價(jià)

2.7.1 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)

在NCBI上檢索到的完整的EC水解酶的氨基酸序列有3條。利用NCBI上的blastp功能在蛋白質(zhì)PDB數(shù)據(jù)庫中分別獲得與現(xiàn)存的EC水解酶序列相似度最高的氨基酸序列。RhodococcusequistrainTB-60的EC水解酶氨基酸序列與BacteriumCSBL00001的芳基?；０访?PBD：4YJ1_A)同源性最高，為33.81%。LysinibacillusfusiformisSC02的EC水解酶氨基酸序列與PseudomonasaeruginosaPAO1的谷氨酰胺基轉(zhuǎn)移酶A亞基(PDB：4WJ3_A)同源性最高，為39.47%。Candidaparapsilosis的EC水解酶氨基酸序列與Rattusnorvegicus的脂肪酸酰胺水解酶(PBD: 1MT5_A)同源性最高，為27.98%。由于使用SWISS-MODEL進(jìn)行建模時(shí)，同源序列要大于30%，故對(duì)Candidaparapsilosis的EC水解酶進(jìn)行建模時(shí)，使用I-TASSER。預(yù)測(cè)得到的三維結(jié)構(gòu)中(見圖7a、7b、7c)，α-螺旋用紅色表示，β-折疊用黃色表示，綠色為無規(guī)則卷曲，總體來看，EC水解酶的三維結(jié)構(gòu)均以α-螺旋以及無規(guī)則卷曲為主，這預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)相對(duì)應(yīng)。

2.7.2 蛋白質(zhì)三維模型的評(píng)價(jià)

使用在線軟件SAVES中的Verify_3D以及拉氏構(gòu)象圖對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。RhodococcusequistrainTB-60的EC水解酶的Verify_3D評(píng)分為87.80%；LysinibacillusfusiformisSC02的EC水解酶的Verify_3D評(píng)分為89.44%；Candidaparapsilosis的EC水解酶的Verify_3D評(píng)分為84.39%。

拉氏構(gòu)象圖簡(jiǎn)稱拉氏圖(Ramachandran Plot)，其作用是體現(xiàn)出氨基酸殘基在拉氏圖中的區(qū)域分布。拉氏構(gòu)象圖分為四個(gè)區(qū)，紅色區(qū)域是最合適區(qū)域，該區(qū)域內(nèi)氨基酸數(shù)目越多，則表示該蛋白模型的骨架結(jié)構(gòu)越合理；黃色區(qū)域是允許區(qū)域；淺黃色區(qū)域是最大允許區(qū)；而白色區(qū)域是不允許區(qū)，該區(qū)域氨基酸的構(gòu)象是不合理的。從圖7a、7b、7c可知使用SWISS-MODEL以及I-TASSER所建的EC水解酶模型，處于允許區(qū)的氨基酸殘基都大于90%，并且不允許區(qū)都小于5%。

2.8 蛋白質(zhì)多序列比對(duì)分析

利用在線軟件Clustal Omega中的多序列比對(duì)功能對(duì)3個(gè)EC水解酶與BacteriumCSBL00001的芳基?；０访傅陌被嵝蛄羞M(jìn)行比對(duì)(見圖8)。三個(gè)EC水解酶的序列相似度為29.17%。來自于真菌Candidaparapsilosis的EC水解酶氨基酸序列與兩個(gè)來源于細(xì)菌的相似度較低，與RhodococcusequistrainTB-60序列相似度為14.49%，與LysinibacillusfusiformisSC02序列相似度為15.22%，而來源于細(xì)菌的兩菌株氨基酸序列相似度為31.3%。從圖中可見位于160位左右的氨基酸殘基保守性較強(qiáng)，特別是GGSSGG，這些氨基酸殘基在酰胺酶進(jìn)化過程中具有較強(qiáng)的保守性。

圖8 EC水解酶的多序列比對(duì)結(jié)果Fig.8 Results of multiple sequence alignment of urethane hydrolase

3 討 論

EC作為2A類致癌物質(zhì)，廣泛存在于酒精飲料等發(fā)酵食品中。應(yīng)用微生物酶法去消除EC具有直接、高效的特點(diǎn)。EC水解酶有三個(gè)完整的氨基酸序列得以鑒定，且所發(fā)現(xiàn)的EC水解酶在酸性或者乙醇存在條件下不穩(wěn)定，不能在酒精飲料中得到廣泛的應(yīng)用。如果能利用分子生物學(xué)的手段對(duì)EC水解酶進(jìn)行改造，使其能被應(yīng)用于食品生產(chǎn)過程中，降低食品中EC的濃度，具有重要意義。

生物信息學(xué)作為一門交叉學(xué)科，利用數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、生命科學(xué)技術(shù)理論和工具，在生物科學(xué)領(lǐng)域的信息獲取、加工、儲(chǔ)存、分析等方面發(fā)揮著重要的作用。本研究利用生物信息學(xué)相關(guān)方法，在NCBI中查找到三條完整編碼EC水解酶的基因序列，對(duì)其編碼的氨基酸序列組成、基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析，通過軟件預(yù)測(cè)蛋白的親疏水性、信號(hào)肽、跨膜域，更進(jìn)一步預(yù)測(cè)了蛋白的二級(jí)以及三維結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，三個(gè)蛋白序列都具有與酰胺酶家族相同的Amidase保守結(jié)構(gòu)域，證明了目前已公布的EC水解酶都是酰胺酶，與劉慶濤所說的一致[6]。使用計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性時(shí)，蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)是一個(gè)重要的表征。不穩(wěn)定指數(shù)是對(duì)蛋白質(zhì)在實(shí)驗(yàn)中的穩(wěn)定性評(píng)估，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)大于40時(shí)，推測(cè)該蛋白質(zhì)為不穩(wěn)定蛋白，當(dāng)小于40時(shí)為穩(wěn)定蛋白[20]。氨基酸序列理化性質(zhì)分析表明，除RhodococcusequistrainTB-60的EC水解酶為較穩(wěn)定蛋白，其余兩種蛋白均表現(xiàn)為不穩(wěn)定蛋白。在蛋白質(zhì)中，氨基酸之間的親/疏水性相互作用是形成其三級(jí)結(jié)構(gòu)最重要作用力之一，親疏水作用可以驅(qū)使蛋白質(zhì)進(jìn)行折疊，有利于蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。親疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，三個(gè)EC水解酶蛋白均屬于親水性蛋白。對(duì)蛋白的信號(hào)肽以及跨膜域分析表明，三株菌的EC水解酶都不含有跨膜域以及信號(hào)肽。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，EC水解酶都以α-螺旋、無規(guī)則卷曲為主。蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能的研究具有較為重要意義[21]。本研究通過同源建模的方式得到了EC水解酶的三維結(jié)構(gòu)，除對(duì)Candidaparapsilosis的EC水解酶進(jìn)行建模時(shí)，使用I-TASSER，其余兩種均使用SWISS-MODEL進(jìn)行建模。三維結(jié)構(gòu)模型的合理性通過Verify_3D以及Ramachandran Plot進(jìn)行驗(yàn)證。Verify_3D用于評(píng)估模型的三維結(jié)構(gòu)與氨基酸一級(jí)序列結(jié)構(gòu)的相容性，檢測(cè)氨基酸側(cè)鏈構(gòu)象的合理性，SAVES獲得的評(píng)分≥80%，表明側(cè)鏈構(gòu)象合理[22]。三個(gè)蛋白的三維結(jié)構(gòu)的Verify_3D評(píng)分都大于80%，說明側(cè)鏈構(gòu)象合理。在Ramachandran Plot中，模型評(píng)價(jià)要求處于允許區(qū)的氨基酸大于90%，如果二面角中有高于90%的都位于一般允許區(qū)，則可表明其空間結(jié)構(gòu)具有一定的穩(wěn)定性[23-24]。三個(gè)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型中處于允許區(qū)的氨基酸均大于90%，表明模型中所有氨基酸均形成了一個(gè)合理的二面角穩(wěn)定構(gòu)型。

4 結(jié) 論

1) EC水解酶基因編碼472～551 aa，分子量在50～62 kD之間，理論等電點(diǎn)(pI)在5左右，均為酸性親水性蛋白；

2) 目前EC水解酶無跨膜區(qū)和信號(hào)肽；

3) 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示EC水解酶的氨基酸都以α螺旋以及無規(guī)則卷曲為主，螺旋與折疊排列有序；

4) 目前發(fā)現(xiàn)的EC水解酶均屬于酰胺酶家族；

5) 對(duì)EC水解酶進(jìn)行三維模型的構(gòu)建，預(yù)測(cè)結(jié)果質(zhì)量評(píng)估均較好，并使用同源比對(duì)的方法，分析出EC水解酶高保守氨基酸殘基。利用生物信息學(xué)相關(guān)軟件對(duì)EC水解酶蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，為挖掘新的EC水解酶、進(jìn)一步研究EC與EC水解酶結(jié)合位點(diǎn)以及對(duì)EC水解酶的改造提供了理論依據(jù)。