劉中原，劉 石，徐衛(wèi)松，陳雅君，張莉娟，魏戰(zhàn)勇

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002;2.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 中牟 451450)

豬偽狂犬病 (PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起多種家畜和野生動(dòng)物的一種急性傳染病［1］。感染豬偽狂犬病毒的豬臨床癥狀表現(xiàn)為體溫升高，新生仔豬主要表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀，豬偽狂犬病一年四季均可發(fā)生，但以冬春兩季和產(chǎn)仔旺季多發(fā)，往往在分娩高峰時(shí)的母豬舍先發(fā)病，而且?guī)缀趺扛C都發(fā)病，發(fā)病率可達(dá)100%。近一兩年來PRV的持續(xù)性感染和潛在的免疫抑制，給豬的疾病防治工作帶來了很大的困難，并且給我國的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前對該病的藥物治療效果不佳，采用疫苗接種是預(yù)防該病的主要措施。當(dāng)前市場上出售的豬偽狂犬疫苗質(zhì)量參差不齊，對豬群的保護(hù)力也千差萬別，大部分養(yǎng)殖戶對疫苗的含毒量不甚了解就盲目的選用疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防，結(jié)果導(dǎo)致豬群體抗體水平不高，達(dá)不到有效的免疫保護(hù)力。2012年初，新鄭某豬場發(fā)生豬偽狂犬病，起初并沒有懷疑疫苗，對健康豬群緊急免疫豬偽狂犬疫苗之后，也沒有控制住病情。該場經(jīng)理就懷疑豬偽狂犬疫苗含毒量低，免疫豬群之后達(dá)不到有效的免疫力。鑒于市場出售的豬偽狂犬疫苗含毒量的不同，為給養(yǎng)殖戶們選擇疫苗提供參考依據(jù)，根據(jù)普通PCR技術(shù)［2-3］，建立起了對豬偽狂犬疫苗含毒量進(jìn)行鑒定的方法，通過此方法旨在找出含毒量較高的豬偽狂犬疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防，從而提高豬群免疫成功率，達(dá)到降低經(jīng)濟(jì)損失的目的。

1 材料與方法

1.1 疫苗

從市場上購買3種不同廠家生產(chǎn)的豬偽狂犬疫苗，分別標(biāo)記為1號、2號、3號。其中1號豬偽狂犬疫苗含毒量是20頭份，2號豬偽狂犬疫苗含毒量是10頭份的，3號豬偽狂犬疫苗含毒量是20頭份的。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上公布的豬偽狂犬病毒基因保守序列g(shù)h片段上的基因，運(yùn)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0設(shè)計(jì)一對針對豬偽狂犬病毒的gh片段的引物。

上游引物序列為 5'-GCGTGTACTGCGAC TGCGTGTT-3'，下游引物序列為 5'-CGA CCTGGCGTTTATTAACCGAGA-3'。擴(kuò)增片段大小為355 bp，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 主要試劑以及儀器

DNA Marker DL2000大連寶生物工程有限公司生產(chǎn);Protein K(美國 Amresco);SIGMA臺式高速低溫離心機(jī);美國ALPHA INNOTECH紫外凝膠成像儀;PCR儀 (PTC-200型)MJ RESESRCH品牌。瑞興科技有限公司生產(chǎn)的 SDS消化緩沖液、Tris飽和酚、苯酚/氯仿/異戊醇;瓊脂糖購自北京美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。3K30型冷凍離心機(jī) (sigma);微量加樣器 (Eppendorf;S2-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器 (上海);DYY-111-6B型電泳儀 (北京六一儀器廠);DYCP-31B型電泳槽 (北京六一儀器廠);凝膠圖像分析系統(tǒng) (Alpha Innotech);UNICO UV-2102可見紫外分光光度計(jì) (Alpha Innotech)。

1.4 疫苗的稀釋

將標(biāo)記過的1號、2號、3號豬用偽狂犬疫苗用生理鹽水稀釋為每毫升含1頭份豬偽狂犬疫苗毒。取稀釋好的豬偽狂犬1號疫苗1 mL移入高壓過的1.5 mL EP管內(nèi)，在此EP管中取100 μL移入到新EP管內(nèi)，加入900 μL滅菌生理鹽水混勻后即成10倍稀釋物，在10倍稀釋物的 EP管中取100 μL移入到新 EP管內(nèi)，加入900 μL滅菌生理鹽水混勻后即成100倍稀釋物，在100倍稀釋物的EP管中取100 μL移入到新 EP管內(nèi)，加入900 μL滅菌生理鹽水混勻后即成1 000倍稀釋物。采用同樣的方法將2號、3號豬偽狂犬疫苗用生理鹽水做10倍、100倍、1 000倍的稀釋。

1.5 常規(guī)方法提取疫苗病毒DNA

將上述稀釋好的豬偽狂犬疫苗采用蛋白酶K的方法提取病毒 DNA。具體方法是，將疫苗樣品用離心機(jī)8 000 r·min-1離心 3 min。取樣品上清400 μL，加入 400 μL 的 SDS消化緩沖液，7 μL 的蛋白K，55℃消化1.5 h。樣品消化完全之后加入350 μL的Tris飽和酚，然后用離心機(jī)8 000 r·min-1離心3 min。再吸取上清移入新的1.5 mL的EP管內(nèi)，加入比例為 25∶24∶1的酚-氯仿-異戊醇 350 μL，然后用離心機(jī)8 000 r·min-1離心3 min。再吸取上清移入新的1.5 mL的 EP管內(nèi)，加入氯仿-異戊醇350 μL，8 000 r·min-1離心 3 min。用移液槍吸取離心好的上清移入到新的 EP管內(nèi)，加入氯仿350 μL，再8 000 r·min-1離心 3 min。吸取離心好的上清加入新的EP管內(nèi)，再加入等體積的異丙醇，放入-20℃冰箱內(nèi)沉淀40 min。異丙醇沉淀40 min之后，放入離心機(jī)內(nèi)8 000 r·min-1離心3 min，棄去上清。再加入70%的乙醇350 μL放入離心機(jī)內(nèi)8 000 r·min-1離心3 min洗去其他雜質(zhì)，重復(fù)洗滌1次，棄去上清之后，再放入離心機(jī)內(nèi)8 000 r·min-1離心1 min。取出樣品，放在 EP管架上，自然干燥30 min之后加入20 μL的三蒸水洗脫DNA?？梢灾苯赢?dāng)做模版PCR反應(yīng)，也可以放在-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 PCR擴(kuò)增

采用的PCR反應(yīng)體系是25 μL反應(yīng)體系，體系組份如下:每一個(gè)反應(yīng)管中加2倍PCR Taq Mix 8 μL(組 成 為 400 μmol dNTP each;0.2 U Taq DNA Poly-merase·μL-1;100 mmol KCl;20 mmol Tris-HCl;3 mmol MgCl2);豬偽狂犬病毒gh基因上、下游引物 (引物濃度為20 pmol·μL-1)每一個(gè)反應(yīng)管中分別為1 μL，提取的DNA作為PCR反應(yīng)體系中的模板，每一個(gè)反應(yīng)管中加2 μL，最后每一個(gè)反應(yīng)管中補(bǔ)加高壓過的雙蒸水13 μL。按照優(yōu)化過后的豬偽狂犬病毒gh基因片段的程序進(jìn)行擴(kuò)增:95℃變性10 min，94℃ 45 S，退火溫度54℃ 30 S，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10 min，4℃保持10 min。PCR程序反應(yīng)結(jié)束之后，取5 μL PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物，進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用紫外凝膠成像儀照相，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果和分析

2.1 對豬偽狂犬疫苗毒稀釋倍數(shù)的優(yōu)化

參考一些 PCR檢測［4-6］的方法，將樣品進(jìn)行1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32 和 1∶102 4的倍比稀釋進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳結(jié)果顯示幾種稀釋倍數(shù)之間的擴(kuò)增結(jié)果差異不顯著，而且耗時(shí)、費(fèi)力。經(jīng)過稀釋倍數(shù)條件優(yōu)化得到 1∶10倍、1∶100倍、1∶1 000倍的稀釋能達(dá)到較好的試驗(yàn)結(jié)果，并且節(jié)省了大量的時(shí)間和金錢。

2.2 對PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

對PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果2倍PCR Taq Mix 8 μL;上、下游引物 1 μL;模版 2 μL;ddH2O 13 μL;PCR擴(kuò)增程序優(yōu)化為 95℃變性10 min，94℃ 45 S，退火溫度54℃ 30 S，72℃1 min，共30個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10 min，4℃保持10 min。

2.3 對豬偽狂犬病毒疫苗PCR擴(kuò)增電泳的檢測

對每一種豬偽狂犬病毒疫苗稀釋為4管，提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增之后，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示。1號豬偽狂犬疫苗10倍稀釋之后電泳條帶就不太亮了，100倍稀釋之后就沒有電泳條帶了，說明1號豬偽狂犬疫苗的抗原含量低，若用于臨床上豬群的免疫預(yù)防很可能起不到良好的免疫保護(hù)力。而從市場購買的2號豬偽狂犬疫苗在稀釋1 000倍之后還能夠隱約看到電泳條帶，說明其抗原含量高，若采用抗體效價(jià)的表示方法來計(jì)算其含毒量的話，疫苗含毒量高達(dá)210可以應(yīng)用于豬群的免疫預(yù)防。同樣的道理，3號豬偽狂犬疫苗含毒量約27，免疫豬群之后也能產(chǎn)生較好的免疫力。

圖1 1-3號豬偽狂犬疫苗PCR擴(kuò)增結(jié)果

3 小結(jié)和討論

從2011年至今豬偽狂犬病在我國部分地區(qū)接連不斷的發(fā)生，給我國養(yǎng)殖業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。有些養(yǎng)殖戶開始懷疑市場上出售的豬偽狂犬疫苗抗原效價(jià)不高，達(dá)不到理想的免疫保護(hù)力，他們急需知道自己所使用的豬偽狂犬疫苗質(zhì)量的好壞。有報(bào)道［7］稱，進(jìn)口的豬偽狂犬疫苗引發(fā)了偽狂犬病的流行，那么我國當(dāng)前市場的豬偽狂犬疫苗含毒量能不能有效的保護(hù)豬群的健康，不僅是每一個(gè)養(yǎng)殖戶想知道的，對于我們科研工作者也是想迫切知道的。陳偉杰等［8］比較了三種 ELISA試劑盒對豬偽狂犬病gE抗體的檢測效果，羅飛等［9］建立了血清中豬偽狂犬gB抗體的ELISA檢測方法，由此可見利用ELISA技術(shù)檢測抗體效價(jià)的技術(shù)比較成熟。而利用ELISA技術(shù)檢測豬偽狂犬病毒抗原的報(bào)道很少，從疫苗中檢測抗原的含量來評價(jià)疫苗的相關(guān)文獻(xiàn)在國內(nèi)就更少見了。

本試驗(yàn)根據(jù)抗體效價(jià)檢測的一般原理，采用疫苗抗原倍比稀釋的方法對市場上出售的豬偽狂犬疫苗進(jìn)行PCR檢測，使抗原檢測與PCR技術(shù)得到了完美的結(jié)合，得到了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，能夠?yàn)榕R床上選用豬偽狂犬疫苗提供參考。也可以采用此方法對市場上出售的其他疫苗進(jìn)行含毒量的檢測，為臨床的使用提供參考依據(jù)。

筆者建立的利用PCR技術(shù)檢測疫苗抗原的方法，能夠省去繁重的勞動(dòng)強(qiáng)度、節(jié)省大量的時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本，為疫苗抗原檢測提供了一條新的思路。

［1］ 殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)［M］.2版.北京:科學(xué)出版社，1997:998-1009.

［2］ 趙麗，崔保安，方忠意，等.PCR檢測豬偽狂犬病病毒方法的研究應(yīng)用 ［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，29(2):143-145.

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［9］ 羅飛，李宇琴，陳義平，等.豬偽狂犬病血清抗體 gBELISA檢測方法的建立 ［J］.中國獸藥雜志，2011，45(7):10-13.