孫紅旭，馬鴻斌，薛國忠，崔慶榮

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020；3.甘肅省中醫(yī)藥管理局，甘肅 蘭州 730000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最嚴(yán)重也是最常見的慢性并發(fā)癥之一，它引發(fā)的終末期腎功能衰竭正在成為威脅糖尿病患者生命的主要原因。中醫(yī)藥在輔助西藥治療該病方面有一定的特色和優(yōu)勢。實(shí)脾飲出自《濟(jì)生方》，由附子、干姜、茯苓、白術(shù)、木瓜、厚樸、木香、大腹子、草果、甘草、生姜、大棗組成，具有溫陽健脾、行氣利水等功效。本研究選用高糖高脂飼料合并STZ注射，再予以腺嘌呤加寒涼藥的方法建立大鼠 DN 脾腎陽虛型動(dòng)物模型，觀察其藥效特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

雄性SD大鼠(SPF級)70只，體質(zhì)量200～240 g,由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號：SCXF(甘)2011-0021。

1.2 藥品、試劑與儀器

實(shí)脾飲，藥材來源于甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院。貝那普利片，上海新亞藥業(yè)閔行有限公司產(chǎn)品,批號H20044840。鏈尿佐菌素(STZ)，購自美國Sigma公司，批號100K20090523, 臨用前用預(yù)先高壓滅菌的0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液 (pH值 4.4) 配成10 g/L的溶液。腺嘌呤,上海新興化工試劑研究所提供，批號061188；內(nèi)皮素(ET)放射免疫分析藥盒，北京北方生物技術(shù)研究所提供，批號110820；一氧化氮(NO)試劑盒，南京建成生物工程研究所提供，批號20111111；轉(zhuǎn)換生長因子β1(TGF-β1)測定試劑盒，上海史瑞克生物科技有限公司提供，批號20110812。GC-911r放射免疫計(jì)數(shù)器及KDC-2044低速冷凍離心機(jī)，均為科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司產(chǎn)品；UV-2401PC分光光度儀，日本島津產(chǎn)品；B60-32FB3-F01型顯微鏡，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；XYJ-80-2型電動(dòng)離心機(jī)，金壇市恒豐儀器廠產(chǎn)品；TG328B型光學(xué)讀數(shù)分析天平，湘儀天平儀器廠生產(chǎn)；日立7170全自動(dòng)生化儀，日本HITACH產(chǎn)品；血糖檢測儀，德國拜耳公司產(chǎn)品。

1.3 糖尿病腎病模型的建立

將70只大鼠按體質(zhì)量編號,以隨機(jī)數(shù)字表法抽取10只為空白對照組,全程用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)(總熱量15.335 J/g,碳水化合物熱卡占53%,脂肪熱卡占9%,蛋白質(zhì)熱卡占20%)；其余60只均以高糖高脂飼料(脂肪 41% ，蛋白 17% ，碳水化合物 42%)喂養(yǎng)4周。第5周將60只大鼠禁食12 h后，按 30 μg/g的劑量腹腔內(nèi)注射STZ檸檬酸溶液1次，3 d后再同劑量注射1次。末次注射STZ 1周后,用腺嘌呤350 mg/(kg·d)加苦寒中藥煎劑(龍膽草、梔子、番瀉葉)4 mL/(kg·d)混合灌服,連續(xù)2周。測血糖、尿糖及尿量。造模大鼠若血糖值高于16.7 mmol/L、尿糖在++以上(含++)、尿量增加多于1倍，出現(xiàn)蛋白尿，大鼠表現(xiàn)出陽虛癥狀者提示造模成功[1-3]。

1.4 分組與給藥

取造模成功大鼠50只，隨機(jī)分為模型對照組、貝那普利組[4]及實(shí)脾飲高、中、低劑量組共5組，每組10只。各組分別灌胃相應(yīng)的藥物，大鼠與人之間藥物劑量的換算按照文獻(xiàn)[3]所載公式計(jì)算。實(shí)脾飲高、中、低劑量組按10 μL/g灌胃實(shí)脾飲混懸液，劑量分別為15，7.5，3.75 g/(kg· d)，相當(dāng)于人用藥量的 10，5，2.5倍；貝那普利組灌胃懸液1×10-3g/kg，模型對照組及空白對照組按10 g/kg 灌胃蒸餾水。共給藥8周。

1.5 檢測指標(biāo)與方法

①造模后觀察大鼠一般狀態(tài)[3]。②于給藥前及給藥后8周檢測空腹血糖。③給藥后第8周末,檢測并記錄體質(zhì)量，處死前一天收集24 h尿液；脫臼處死所有大鼠，股動(dòng)脈采血，以3500 r/min離心10 min,分離血清,于-25 ℃冰箱內(nèi)保存以檢測SCr、ET、NO、TGF-β1含量；迅速取出雙側(cè)腎臟，鹽水洗滌，稱量其濕質(zhì)量。其中大鼠腎臟濕質(zhì)量用光學(xué)讀數(shù)分析天平稱量；24 h尿蛋白定量、FBG、SCr用日立7170全自動(dòng)生化儀測定；ET采用放射免疫法測定，NO采用硝酸還原酶法測定，均按試劑盒說明書進(jìn)行；血清TGF-β1含量用酶聯(lián)免疫吸附法測定，具體操作按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況對比

模型對照組大鼠明顯消瘦，多飲、多尿，精神萎靡，倦怠，蜷縮，反應(yīng)遲鈍，動(dòng)作遲緩，毛發(fā)無光澤。貝那普利組亦有類似表現(xiàn)，但程度較輕。實(shí)脾飲高、中劑量組大鼠體質(zhì)量增加，精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏，動(dòng)作自如，毛發(fā)光澤。實(shí)脾飲低劑量組大鼠精神狀況、反應(yīng)、毛色較高、中劑量組差，但較模型對照組和貝那普利組好。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量、腎指數(shù)對比

與模型對照組對比，實(shí)脾飲高、中劑量組大鼠體質(zhì)量明顯增加, 腎指數(shù)均降低, 差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；貝那普利組及實(shí)脾飲低劑量組的大鼠體質(zhì)量和腎臟指數(shù)均無明顯改善(P>0.05)。與貝那普利組對比，實(shí)脾飲高、中劑量組腎臟指數(shù)降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、腎指數(shù)對比 ±s

2.3 各組大鼠FBG對比

與模型對照組對比，實(shí)脾飲高、中、低劑量組大鼠FBG下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；貝那普利組FBG較之差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明貝那普利無明顯降糖效果，見表2。

表2 各組大鼠FBG對比

2.4 各組大鼠SCr對比

與模型對照組對比，實(shí)脾飲高、中劑量組大鼠SCr下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；貝那普利組和實(shí)脾飲低劑量組無明顯改善，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明貝那普利和實(shí)脾飲低劑量降低SCr的作用不明顯，見表3。

表3 各組大鼠SCr對比

2.5 各組大鼠24 h尿蛋白定量對比

與模型對照組對比，實(shí)脾飲高、中劑量組和貝那普利組大鼠24 h尿蛋白量下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);實(shí)脾飲低劑量組無明顯改善，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明實(shí)脾飲高、中劑量及貝那普利均有降低大鼠尿蛋白的作用，而實(shí)脾飲低劑量降低大鼠尿蛋白作用不明顯。實(shí)脾飲高劑量組24 h尿蛋白量與貝那普利組對比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明實(shí)脾飲高劑量的療效較佳；實(shí)脾飲中劑量組較之，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明二者療效相當(dāng)。見表4。

注：與空白對照組對比，* P<0.05；與模型對照組對比，# P<0.05；與貝那普利組對比，△ P<0.05。

2.6 各組大鼠血清NO、ET對比

與模型對照組對比，各治療組NO升高、ET降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明各藥物均有升高大鼠NO、降低ET的功效。實(shí)脾飲高、中劑量組NO、ET與貝那普利組對比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明實(shí)脾飲高、中劑量較貝那普利療效顯著；實(shí)脾飲低劑量組與貝那普利組對比，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明二者療效相當(dāng)；實(shí)脾飲高劑量組與中劑量組對比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明實(shí)脾飲高劑量療效較佳。見表5。

注：與空白對照組對比，* P<0.05；與模型對照組對比，# P<0.05；與貝那普利組對比，△ P<0.05；與高劑量組對比，＊ P<0.05。

2.7 各組大鼠血清TGF-β1對比

模型對照組大鼠血清TGF-β1含量與空白對照組對比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。各治療組與模型對照組對比，大鼠血清TGF-β1含量在實(shí)脾飲高、中劑量組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，說明治療均有效；實(shí)脾飲高劑量組大鼠血清TGF-β1與貝那普利組對比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示貝那普利和實(shí)脾飲均能降低大鼠血清TGF-β1含量；實(shí)脾飲高劑量組降低大鼠血清TGF-β1含量效果更明顯。見表7。

注：與空白對照組對比，** P<0.01；與模型對照組對比，# P<0.05，## P<0.01；與貝那普利組對比，△△ P<0.01。

3 討 論

3.1 選方依據(jù)

糖尿病腎病屬中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇。一般認(rèn)為該病初起多為陰虛燥熱，日久發(fā)展為糖尿病腎病，此過程中脾腎陽虛多起著決定性作用，為其基本病機(jī)[5]?！短绞セ莘健分刑岬剑骸叭?，本起腎虛或食肥美之所發(fā)也。腰腎冷者陽氣以衰……故成病矣?！泵鞔_指出了消渴病是由于腎虛及飲食不節(jié)而引起，腎陽氣虛衰，不能上助脾陽，故而發(fā)為本病。實(shí)脾飲出自《濟(jì)生方》，以附子、干姜為君，附子溫腎陽而助氣化，干姜溫脾陽而助運(yùn)化，二藥相合，溫腎健脾，溫補(bǔ)脾腎之陽；臣以茯苓、白術(shù)滲濕健脾，使水濕從小便而去；佐以木瓜除濕醒脾和中，厚樸、木香、大腹子、草果行氣導(dǎo)滯，氣化則濕化，氣順則脹消，且草果、厚樸兼可燥濕，大腹子兼能利水，甘草、生姜、大棗益脾和中，生姜兼溫散水氣之功，甘草尚能調(diào)和諸藥，同為佐使。諸藥相伍，脾腎同治，而以溫脾陽為主；寓行氣于溫利之中，令氣行則濕化。臨床療效亦表明，實(shí)脾飲為符合糖尿病腎病病機(jī)、治法的有效組方。

3.2 模型評價(jià)

高糖高脂飼料加STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠模型為目前普遍采用的造模方法之一。本實(shí)驗(yàn)為了模仿該病中醫(yī)病理特點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上選用腺嘌呤加寒涼藥的方法。造模大鼠出現(xiàn)攝食減少，形體消瘦，身體蜷縮，體毛無光澤，反應(yīng)遲鈍，精神萎靡，體質(zhì)量下降，血糖升高，大量蛋白尿，腎功能損害等，提示造模成功。

3.3 指標(biāo)特點(diǎn)

腎小球?yàn)V過率(GFR)的檢測一般是要根據(jù)其他物質(zhì)水平的測定來確定，被測物質(zhì)分為外源性和內(nèi)源性。其中外源性的測定24 h尿蛋白定量可以準(zhǔn)確的評估出GFR水平[6]。內(nèi)源性物質(zhì)中，SCr是一種相對較理想的指標(biāo)，能夠直接、靈敏的反映GFR的程度，特異性較高[7-8]。實(shí)驗(yàn)表明：體內(nèi)NO和ET應(yīng)處于一種動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，以保證血流動(dòng)力學(xué)的穩(wěn)定。糖尿病腎病初期NO升高，使腎臟入球小動(dòng)脈擴(kuò)張，導(dǎo)致腎小球系膜舒張，損傷。接著，ET代償性分泌增多，水平逐漸上升，NO水平逐漸下降，進(jìn)一步加劇了腎小球硬化的過程[9]。TGF-β1能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、ECM形成和組織纖維化的作用，TGF-β1在DN中介導(dǎo)腎臟纖維化發(fā)展的過程[10]。

3.4 結(jié)論與展望

本課題研究結(jié)果顯示:實(shí)脾飲能改善 DN 大鼠的一般狀況，增加體質(zhì)量，降低腎指數(shù)，降低FBG、SCr、24 h尿蛋白定量、ET、TGF-β1含量，升高大鼠血清NO含量，進(jìn)而減輕腎組織的病理損害，延緩腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化進(jìn)程，對 DN 有很好的保護(hù)作用。但在實(shí)脾飲中發(fā)揮作用的有效成分及其作用靶點(diǎn)與機(jī)制仍不清楚，且并未證明實(shí)脾飲高劑量是否是最優(yōu)劑量，故日后應(yīng)向方藥作用基礎(chǔ)研究方面努力，包括實(shí)脾飲的作用機(jī)制、藥理研究、量效關(guān)系、配伍效應(yīng)及藥代動(dòng)力學(xué)等方面的研究。

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