離子色譜法測定鹽酸法舒地爾中高哌嗪含量*

張錦梅，王珊珊，楊蘭玲

（青島盛瀚色譜技術(shù)有限公司，山東青島 266101）

鹽酸法舒地爾（fasudil hydrochloride），化學(xué)名稱為六氫-1-(5-磺酰基異喹啉)-1(H)-1，4-二氮雜卓鹽酸鹽，是一種肌球蛋白輕鏈磷酸化酶、RHO 激酶抑制劑和新型細胞內(nèi)鈣離子抗結(jié)劑，該藥能改善腦組織微循環(huán)，保護缺血腦組織，促進神經(jīng)再生。高哌嗪是鹽酸法舒地爾合成工藝中用到的一種原料［1］，通常要求其相對于鹽酸法舒地爾的殘留量不得超過0.1%。已有文獻報道采用液相色譜法［2–3］、紫外分光光度法［4］檢測鹽酸法舒地爾中法舒地爾含量及氣相色譜法［5］測定鹽酸法舒地爾中殘留溶劑的含量。而至今未見關(guān)于離子色譜法檢測鹽酸法舒地爾及原料高哌嗪的報道。筆者建立了非抑制電導(dǎo)陽離子色譜法測定鹽酸法舒地爾原料藥中高哌嗪的含量，方法準確度高、精密度好、簡便易行，可用于鹽酸法舒地爾生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

離子色譜儀：CIC–300 型，內(nèi)置柱溫箱，青島盛瀚色譜技術(shù)有限公司；

優(yōu)普超純水機：UPL–II 型，成都優(yōu)普純水儀有限公司；

電子天平：AL 104 型，瑞士梅特勒–托利多儀器有限公司；

甲烷磺酸：分析純，國藥集團藥業(yè)有限公司；

乙腈：色譜純，德國Merk 公司；

高哌嗪對照品、鹽酸法舒地爾：某制藥廠提供；

實驗用水均為超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）。

1.2 色譜條件

色 譜 柱：SH–CC–3 柱（100 mm×4.6 mm）；淋 洗 液：5.0 mmol／L 甲 烷 磺 酸– 乙 腈（體 積 比90∶10），流速為0.7 mL／min；柱溫：30 ℃；直接電導(dǎo)檢測；進樣量：100 μL。

1.3 溶液配制

高哌嗪對照品溶液：1 mg／mL，精密稱取高哌嗪對照品適量，用超純水溶解并稀釋而成；

系統(tǒng)適用性試驗溶液：準確稱取鹽酸法舒地爾和高哌嗪對照品適量，用超純水溶解并稀釋制成鹽酸法舒地爾質(zhì)量濃度為3 mg／mL、高哌嗪質(zhì)量濃度為3 μg／mL 的混合溶液，作為系統(tǒng)適用性試驗溶液；

供試品溶液：取鹽酸法舒地爾約0.5 g，精密稱定，置于25 mL 量瓶中，加超純水溶解并稀釋至標線，搖勻，作為供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 淋洗液的選擇

高哌嗪的測定參照離子色譜測試方法（中國藥典2010 年版二部附錄VJ［6］）規(guī)定。根據(jù)法舒地爾及高哌嗪的化學(xué)結(jié)構(gòu)選擇以羧酸基鍵合硅膠基質(zhì)作為填料的離子色譜柱。分別研究了濃度為2.5，5.0，7.5 mmol／L 甲烷磺酸淋洗條件下系統(tǒng)適用性試驗中高哌嗪和法舒地爾的出峰及分離情況。試驗發(fā)現(xiàn)即使甲烷磺酸濃度高達7.5 mmol／L 時，60 min 內(nèi)只有高哌嗪能夠出峰，法舒地爾不出峰，且高哌嗪峰與系統(tǒng)峰分離效果不佳。因此考慮選取在中間濃度5 mmol／L 甲烷磺酸淋洗液中加入一定量的有機溶劑（如乙腈）來縮短法舒地爾出峰時間。由于此款色譜柱所容許耐受的有機溶劑的最高使用極限為15%（體積分數(shù)），故選擇乙腈的體積分數(shù)為5%，10%，15%進行對比試驗。結(jié)果表明，當乙腈體積分數(shù)為5%時，分析時間太長無法滿足要求；當乙腈體積分數(shù)為10%，15%時，分析時間可以滿足要求?？紤]到色譜柱使用過程中長期處于有機溶劑最大耐受極限可能會縮短色譜柱的使用壽命，甚至造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷，故最終選擇5 mmol／L 甲烷磺酸添加10%乙腈作為淋洗液，既可以滿足實驗需要又能保證在合適的條件下使用色譜柱。

2.2 淋洗液流速的選擇

除淋洗液組成外，淋洗液流速也是影響分離度和色譜峰形的關(guān)鍵因素之一。實驗考察了淋洗液流速分別為0.5，0.7，0.9 mL／min 時對分離效果的影響。結(jié)果表明，低流速下分析時間長，色譜峰形不好；而較高流速下，柱子長時間在高壓狀態(tài)下工作容易造成柱子損傷；當流速為0.7 mL／min 時柱壓適宜且分離效果良好、峰形理想，滿足實驗要求。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

按照1.2 色譜條件及進樣方法，做系統(tǒng)適用性試驗，色譜圖見圖1。圖1 色譜圖中，高哌嗪和法舒地爾的分離度為6.6，理論塔板數(shù)按高哌嗪峰計算大于1 000。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗溶液色譜圖

2.4 工作曲線方程

精密吸取高哌嗪對照品溶液，逐級稀釋后配制成質(zhì)量濃度分別為2.0，4.0，8.0，10.0，20.0 μg／mL的系列標準溶液，在1.2 色譜條件下測定。以色譜峰面積Y對高哌嗪質(zhì)量濃度X進行線性回歸，得線性回歸方程為Y=2.0×107X–2 159.2，相關(guān)系數(shù)r=0.992 4。高哌嗪對照品溶液色譜圖見圖2。

圖2 高哌嗪對照品溶液色譜圖

2.5 檢出限與定量限

稀釋高哌嗪對照品溶液并進樣分析，至高哌嗪色譜峰近基線波動，重復(fù)進樣3 次。當S／N=3∶1時，計算高哌嗪的檢出限為0.049 4 μg／mL；當S／N=10∶1 時，計算高哌嗪的定量限為0.151 μg／mL。

2.6 精密度試驗

取對照品溶液，在1.2 色譜條件下連續(xù)進樣6 次，高哌嗪峰面積測定結(jié)果的相對標準偏差為0.47%，結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗結(jié)果

2.7 空白樣品測定

對6 份空白鹽酸法舒地爾樣品溶液進樣分析，結(jié)果顯示，樣品溶液中未檢出高哌嗪殘留，見圖3。

圖3 空白供試品溶液色譜圖

2.8 回收試驗

在3 mg／mL 空白鹽酸法舒地爾溶液中加入2.4，3.0，3.6 μg／mL 3 個水平的高哌嗪溶液進行加標回收試驗，結(jié)果見表2。由表2 可知加標回收率為97.6%～98.7%。

2.9 耐用性試驗

在1.2 色譜條件下，分別控制淋洗液流速（0.7mL／min）變化±0.14 mL／min、柱溫（30℃）變化±5℃、甲烷磺酸濃度（5.0 mmol／L）變化±2.5 mmol／L、乙腈體積分數(shù)（10%）變化±5%時，計算對照品溶液色譜峰面積結(jié)果的相對標準偏差，結(jié)果見表3。由表3可知，在所選實驗參數(shù)變化范圍內(nèi)，高哌嗪對照品峰面積的相對標準偏差小于0.5%，證明了所建立方法的可靠性。

表2 加標回收試驗結(jié)果

表3 耐用性試驗結(jié)果

3 結(jié)語

采用離子色譜法測定鹽酸法舒地爾中高哌嗪含量，具有靈敏度、準確度高，精密度好，操作簡便等優(yōu)點，為鹽酸法舒地爾的質(zhì)量控制提供了參考。該法適用于實際生產(chǎn)中中間體測定與成品的快速檢測，減少了液相色譜分析中有機相的使用，有利于環(huán)境環(huán)保。

［1］ 姚建文，王成鵬，張秀娟，等.鹽酸法舒地爾的合成［J］.齊魯藥事，2012，31(8): 438–439.

［2］ 葛欣，孟祥軍，李娜然.測定鹽酸法舒地爾的有關(guān)物質(zhì)［J］.光譜實驗室，2011，28(4): 1 908–1 910.

［3］ 樂健，石寬，聞俊，等.用HPLC 法測定鹽酸法舒地爾注射液中鹽酸法舒地爾的含量［J］.藥學(xué)服務(wù)與研究，2012，12(1): 14，24.

［4］ 呂潔，孟祥軍，鄒春陽.紫外–可見分光光度法測定鹽酸法舒地爾注射液中鹽酸法舒地爾的含量［J］.中國醫(yī)藥指南，2011，9(5): 26–28.

［5］ 陳晶晶，雷咪，干偉，等. GC 法檢測鹽酸法舒地爾中有機溶劑殘留量［J］.中國藥師，2012，15(3): 365–366.

［6］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.