何長(zhǎng)青，王紅霞，付 甜，黃芳芳，閆麗君，徐剛標(biāo)

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 林木遺傳育種實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.國(guó)家林業(yè)局 林產(chǎn)工業(yè)規(guī)劃設(shè)計(jì)院，北京 100010）

觀光木cpDNA非編碼序列PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選

何長(zhǎng)青1，王紅霞2，付 甜1，黃芳芳1，閆麗君1，徐剛標(biāo)1

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 林木遺傳育種實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.國(guó)家林業(yè)局 林產(chǎn)工業(yè)規(guī)劃設(shè)計(jì)院，北京 100010）

利用單因素與正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)影響觀光木cpDNA-PCR擴(kuò)增的主要因子進(jìn)行優(yōu)化，建立了觀光木cpDNA-PCR 最 適 反 應(yīng) 體 系（20 μL)， 為：50 ng 模 板 DNA、1×PCR buffer、0.2 μmol·L-1引 物、2 mmol·L-1MgCl2、0.3 mmol·L-1dNTP以及1 UTaqDNA 聚合酶；篩選出了適合觀光木分子譜系地理學(xué)研究的非編碼區(qū)序列引物，為rpl32-trnL、psbJ-petA、3′rps16-5′trnK、atpI-atpH、petL-psbE。

觀光木；cpDNA；非編碼序列PCR；體系優(yōu)化；引物篩選

觀光木Tsoongiodendron odorum系木蘭科常綠喬木，蟲(chóng)媒傳粉[1]，為我國(guó)珍稀孑遺樹(shù)種，屬國(guó)家II級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物[2]，對(duì)被子植物系統(tǒng)發(fā)育以及系統(tǒng)分類方面具有重要的科學(xué)意義。在我國(guó)，觀光木零散分布于長(zhǎng)江流域以南海拔300～1 100 m 的山地常綠闊葉林中[3-4]，天然種群很小，為我國(guó)極小種群野生植物[5]。

觀光木的研究主要集中在觀光木的生物學(xué)特性、生態(tài)學(xué)特征、引種繁殖、化學(xué)成分和遺傳多樣性等方面[5-6]。分子譜系地理學(xué)是揭示種群遺傳多樣性、推測(cè)種群進(jìn)化過(guò)程中的歷史事件、探討近緣物種親緣關(guān)系的重要手段，已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視。葉綠體DNA（Chrloroplast DNA，cpDNA）非編碼序列具有較高的核苷酸置換率，能揭示種間和種內(nèi)遺傳變異，多態(tài)性豐富，能提供對(duì)系統(tǒng)發(fā)育研究的信息位點(diǎn)[7-8]。本研究通過(guò)對(duì)影響觀光木cpDNA標(biāo)記PCR反應(yīng)體系主要因子進(jìn)行優(yōu)化，篩選出適宜的非編碼區(qū)序列引物，為進(jìn)一步開(kāi)展瀕危植物觀光木分子譜系地理學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

材料采集于貴州省從江縣。新鮮葉片經(jīng)硅膠干燥后，帶回實(shí)驗(yàn)室于-70℃冰箱中保存。cpDNA非編碼序列標(biāo)記通用引物序列參考文獻(xiàn) [9-11]，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.2 基因組DNA提取與檢測(cè)

采用改良的CTAB法提取觀光木總DNA[12]。用Eppendorf 公司生產(chǎn)的 Biophotometer 核酸蛋白分析儀檢測(cè) DNA 濃度和純度，用 0.8% 瓊脂糖凝膠對(duì)提取的總 DNA 進(jìn)行電泳，用Syngene公司生產(chǎn)的 G-BOX 紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察 DNA 是否污染。

1.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

[9-10]。觀光木DNA PCR擴(kuò)增初始反應(yīng)體系（20 μL）為：50 ng模板DNA，1×PCR buffer，0.1 μmol·L-1引物，3.0 mmol·L-1MgCl2，0.2 mmol·L-1dNTP，1 UTaqDNA聚合酶。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min，4 ℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。電泳緩沖液為1×TAE，電壓5 V/cm。在G-BOX紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。

1.4 PCR反應(yīng)體系優(yōu)化與引物篩選

以petL-psbE為引物，參考文獻(xiàn)[13-14]，進(jìn)行6個(gè)濃度水平DNA模板用量試驗(yàn)，以確定最適DNA模板用量。對(duì)影響PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和產(chǎn)量的引物、Mg2+、dNTPs、TaqDNA 濃度進(jìn)行單因素梯度試驗(yàn)（見(jiàn)表1）。根據(jù)單因子確定的各因素最適濃度范圍，進(jìn)行4因素4水平正交試驗(yàn)（見(jiàn)表2）。

表1 PCR反應(yīng)體系優(yōu)化的因素與水平Table 1 Factors and levels of PCR reaction system

利用優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系，對(duì)文獻(xiàn)[9-11]中的cpDNA非編碼序列通用引物進(jìn)行篩選。對(duì)篩選出的最適cpDNA非編碼序列引物，以Tm值計(jì)算理論退火溫度，以理論值為中心，設(shè)置梯度為1℃的6個(gè)退火溫度，最終確定引物的最佳退火溫度。

表2 PCR正交設(shè)計(jì)Table 2 PCR orthogonal design

1.5 最適反應(yīng)體系的驗(yàn)證

利用篩選出的最適引物對(duì)從江種群17株觀光木進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA純度與濃度

觀光木樣本提取總DNA，通過(guò)核酸蛋白分析儀檢測(cè) DNA 濃度和純度。結(jié)果表明，提取的DNA的OD260nm/ OD280nm值在1.6～2.0之間，符合PCR擴(kuò)增的要求。

2.2 PCR反應(yīng)體系單因子試驗(yàn)

6個(gè)水平濃度的DNA模板擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，不同濃度DNA模板都能擴(kuò)增出產(chǎn)物，但隨著DNA模板用量的增加，PCR擴(kuò)增條帶越來(lái)越亮，DNA模板用量為50 ng時(shí)，擴(kuò)增帶條最明亮，之后，隨濃度增加，擴(kuò)增條帶變暗。由此可見(jiàn)，觀光木cpDNA PCR擴(kuò)增體系的DNA模板最適濃度為50 ng。

引物、Mg2+、dNTP、TaqDNA聚合酶6種不同濃度的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，引物濃度為 0.3 μmol·L-1、Mg2+濃度為 2.5 mmol·L-1、dNTP 濃 度 為 0.30 mmol·L-1、TaqDNA聚合酶用量為1.0 U時(shí)，PCR擴(kuò)增的條帶最為清晰。

圖1 不同DNA用量對(duì)PCR的影響Fig.1 Effects of different template DNA concentrations on PCR

2.3 PCR反應(yīng)體系正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定上、下游引物濃度 為 0.1 ～ 0.5 μmol·L-1， Mg2+濃 度 為 0.1 ～ 2.5 mmol·L-1， dNTP 濃 度 為 0.15 ～ 0.30 mmol·L-1，TaqDNA聚合酶用量為0.6～1.4 U。采用4因素4水平的正交試驗(yàn)，對(duì)PCR反應(yīng)體系進(jìn)一步優(yōu)化。正交試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，8、12和15組試驗(yàn)的PCR擴(kuò)增條帶清晰明亮，但第8組合的結(jié)果穩(wěn)定性較差。因此，最終確定觀光木cpDNA非編碼序列PCR最佳反應(yīng)體系（20 μL）為：50 ng模板DNA、1×PCR buffer、引物各0.2 μmol·L-1、2.0 mmol·L-1MgCl2、0.3 mmol·L-1dNTP、1 UTaqDNA 聚合酶。

圖2 各單因素用量對(duì)PCR的影響Fig.2 Effects of different factor concentrations on PCR

圖3 PCR正交試驗(yàn)電泳圖譜Fig.3 Electrophoretogram for an orthogonal design of PCR amplif i cation

2.4 觀光木cpDNA引物篩選

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)文獻(xiàn)[9-11]中trnK內(nèi)含 子3914-2R序 列，rpl32-trnL、trnQ-5′rps16、3′trnV-ndhC、ndhF-rpl32、psbD-trnT、psbJ-petA、3′rps16-5′trnK、atpI-atpH、petL-psbE、trnTUGU-trnFGAA、trnCGCA-rpoB、trnDGUC-trnTGGU、trnSGCU-tnGUUC基因間隔序列共14對(duì)引物進(jìn)行篩選。篩選出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物單一、清晰、明亮、穩(wěn)定的5對(duì)引物（見(jiàn)表3）。圖4是5對(duì)引物PCR壙增結(jié)果。

表3 篩選的5對(duì)引物Table 3 Selected five pairs of primers

利用篩選出的5對(duì)cpDNA非編碼序列引物，對(duì)觀光木從江天然種群17株個(gè)體進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，5對(duì)cpDNA非編碼序列引物能擴(kuò)增出清晰的目的片段，表明篩選出的PCR擴(kuò)增體系適合于觀光木分子譜系地理學(xué)研究。

圖4 不同退火溫度對(duì)PCR的影響Fig.4 Effects of different annealing temperature on PCR

3 結(jié) 論

PCR擴(kuò)增結(jié)果受反應(yīng)體系中模板DNA、引物、TaqDNA 聚合酶、Mg2+及dNTP濃度的影響[12-16]。本研究通過(guò)單因素與正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)相結(jié)合的方法，得到了觀光木cpDNA非編碼區(qū)序列引物最適PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系。利用優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系，篩選出適合觀光木分子譜系地理學(xué)研究的rpl32-trnL、psbJ-petA、3′rps16-5′trnK、atpI-atpH和petL-psbE5對(duì)cpDNA非編碼區(qū)序列引物。其中，rpl32-trnL擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為1 200～1 400 bp，psbJ-petA擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為1 100～1 300 bp，3′rps16-5′trnK擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為750～850 bp，atpI-atpH擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為1 100～1 300 bp，petL-psbE擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為1 100～1 300 bp。本研究為后續(xù)擴(kuò)增產(chǎn)物的回收、測(cè)序以及進(jìn)一步開(kāi)展觀光木分子譜系地理學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

圖5 各引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.5 Electrophoretogram for PCR amplif i cation products of each primer

參考文獻(xiàn)：

通盤考察，財(cái)政學(xué)專業(yè)的課程設(shè)置，應(yīng)以學(xué)生綜合發(fā)展為根本導(dǎo)向，若是以直接進(jìn)入就業(yè)市場(chǎng)為主，則在課程設(shè)置上強(qiáng)化實(shí)務(wù)、實(shí)踐課程學(xué)習(xí)，適度安排、設(shè)置語(yǔ)言表達(dá)、溝通交流課程。若是以繼續(xù)攻讀碩士學(xué)位為主，則在課程設(shè)置上以深化理論學(xué)習(xí)為主，強(qiáng)化數(shù)據(jù)分析和文獻(xiàn)資料處理能力的培養(yǎng)。

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Optimization of PCR reaction system and primers screening of cpDNA non-coding regions forTsoongiodendron odorum

HE Chang-qing1, WANG Hong-xia2, FU Tian1, HUANG Fang-fang1, YAN Li-jun1, XU Gang-biao1
( 1. Lab. of Forest Genetics, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China;2. Planning and Design Institute of Forest Products Industry, State Forestry Administration, Beijing 100010, China)

With single factor orthogonal design method, the experiments were conducted to optimize the main elements affecting cpDNA-PCR amplif i cation system forTsoongiodendron odorum. An optimal cpDNA-PCR system forT. odorumwas set up as follows:50 ng DNA template, 1×PCR buffer, 0.3 μmol?L-1primer, 2.5 mmol?L-1MgCl2, 0.3 mmol?L-1dNTP and 1 UTaqDNA polymerase in a total volume of 20 μL. Five pairs of cpDNA non-coding regions primers which are appropriate for the study of molecular genealogy ofT.odorumwere screened out, they are:rpl32-trnL,psbJ-petA,3′rps16-5′trnK,atpI-atpHandpetL-psbE.

Tsoongiodendron odorum; cpDNA; non-coding sequence of PCR; system optimization; primers screening

S759.95；Q948

A

1673-923X(2014)09-0107-05

2014-02-10

國(guó)家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201104033)；十二五國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAC01B07-2）

何長(zhǎng)青（1990-），男，湖南永州人，碩士研究生，主要從事分子種群遺傳學(xué)研究；E-mail：601867297@qq.com

徐剛標(biāo)（1965-），男，安徽樅陽(yáng)人，教授，主要從事植物種群遺傳與林木遺傳改良研究；E-mail：gangbiaoxu@163.com

[本文編校：謝榮秀]