于卓，謝銳，于肖夏，馬艷紅，李造哲，紀明妹

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，內(nèi)蒙古呼和浩特010019)

高丹草是高粱(Sorghum bicolor)與蘇丹草(Sorghum sudanense)的種間雜交后代，具有高粱鮮草產(chǎn)量高、抗逆性強和蘇丹草葉量大、品質(zhì)好等優(yōu)良特性，其不足點是鮮草中含有氫氰酸［1-3］。有研究表明，高丹草品種間氫氰酸含量差異較大，含量高的品種(株高約100 cm時莖葉鮮草氫氰酸含量≥100 mg/kg)家畜采食量大時會出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，給生產(chǎn)帶來嚴重損失［4-6］。選育青刈飼喂安全的超低氫氰酸含量(株高約100 cm時莖葉鮮草氫氰酸含量1～15 mg/kg，青刈后可直接飼喂家畜)高丹草新品種是預防氫氰酸危害的有效措施。

為培育青刈飼喂家畜安全的超低氫氰酸含量高丹草新品種，近年來我們利用在內(nèi)蒙古中西部地區(qū)種植多年的氫氰酸含量低的散穗高粱與黑殼蘇丹草、白殼蘇丹草、紅殼蘇丹草和棕殼蘇丹草相組配進行人工授粉雜交，獲得4個雜交組合的F1代，通過ISSR分子標記輔助選育，得到4個超低氰氫酸含量高丹草新品系SLCN-11(散穗高粱×黑殼蘇丹草F5)、SLCN-12(散穗高粱×白殼蘇丹草F5)、SLCN-13(散穗高粱×紅殼蘇丹草F5)、SLCN-14(散穗高粱×棕殼蘇丹草F5)［7-10］。SSR(simple sequence repeats，簡單重復序列)為共顯性標記，具有多態(tài)性豐富、重復性好等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于牧草和作物的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位及分子標記輔助育種［11-14］。目前，國內(nèi)外有關(guān)SSR標記技術(shù)在高丹草品種或品系鑒定方面的應(yīng)用尚未見有研究報道。本試驗以我們育成登記的高丹草品種蒙農(nóng)青飼3號為對照［15］，重點對上述4個高丹草新品系及其親本進行SSR分析，以明確其在DNA水平上的差異程度，并建立高丹草新品系的SSR指紋圖，為下一步高丹草新品種育成及登記利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料為4個高丹草新品系SLCN-11(散穗高粱×黑殼蘇丹草F5)、SLCN-12(散穗高粱×白殼蘇丹草F5)、SLCN-13(散穗高粱×紅殼蘇丹草F5)、SLCN-14(散穗高粱×棕殼蘇丹草F5)及母本散穗高粱和父本黑殼蘇丹草、白殼蘇丹草、紅殼蘇丹草、棕殼蘇丹草，對照品種為蒙農(nóng)青飼3號高丹草(Sorghum bicolor×Sorghum sudanense cv.Mengnong Qingsi No.3)。各供試材料的種子由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院飼用作物育種研究室提供，試驗于2012年7月至2013年5月在室內(nèi)進行。

1.2 總DNA提取與純度檢測

將各供試材料的種子播種在花盆中，室溫條件下培養(yǎng)成苗，在三葉期每種材料隨機剪取20個單株幼苗的葉片混合，用植物基因組試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取DNA，取5 μL DNA用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度，將各材料的DNA濃度稀釋至50 ng/μL置冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SSR-PCR擴增反應(yīng)

擴增反應(yīng)體系:反應(yīng)液總體積為 20 μL，其中 ddH2O 11.6 μL，10 × Buffer 2.0 μL，Mg2+1.6 μL，dNTP 1.6 μL，Taq 酶 0.2 μL，上游引物 1.0 μL，下游引物 1.0 μL，60 ng/μL 的模板 DNA 1.0 μL。

擴增反應(yīng)程序:在Eppendorf Mastercycler 5331-PCR儀上，95℃變性4 min，1個循環(huán);94℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸90 s，34個循環(huán);72℃延伸10 min，1個循環(huán)后終止反應(yīng)。

聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染檢測:擴增產(chǎn)物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，每樣品點樣8 μL，電泳時間2 h。膠板在0.15%AgNO3溶液中銀染15 min，取出后蒸餾水速漂5 s，放入含有3%NaOH和0.5%甲醛的溶液中顯色10 min，視條帶清晰后轉(zhuǎn)入固定液終止反應(yīng)，蒸餾水清洗2 min后晾干、掃描。

1.4 SSR適宜引物的篩選

利用已開發(fā)的同屬植物高粱的200對SSR引物進行篩選(http://algodon.tamu.edu/sorghumdb.html提供的引物序列，由上海生物工程公司合成)，選出多態(tài)性豐富的適宜引物，用于PCR擴增。試驗重復5次。

1.5 SSR分子標記的數(shù)據(jù)處理

將染色好的膠板放在透射光燈箱上，記錄膠板上清晰的條帶，電泳結(jié)果采取0/1賦值記帶，將所觀察到的每一條帶視為1個單位，有帶記為1，無帶記為0，生成0，1組成的數(shù)據(jù)矩陣，進行統(tǒng)計分析，并計算下列相關(guān)遺傳系數(shù)［16］。

多態(tài)性位點百分率:對于某一位點而言，當變異個體頻率大于0.01時，該位點即為多態(tài)性位點(P):P=(K/N)×100%，式中，K為多態(tài)性位點數(shù)目、N為擴增位點總數(shù)。

供試材料的遺傳相似系數(shù)(GS)和遺傳距離(GD):GS=2Sij/(Si+Sj)，式中，Sij為材料i和材料j共有的條帶數(shù)目，Si+Sj為2種材料中出現(xiàn)的條帶數(shù)目之和;GD=1－GS。根據(jù)類平均法，運用DPS V 8.01分析軟件進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試材料基因組DNA質(zhì)量檢測

用植物基因組試劑盒提取10個供試材料基因組DNA的電泳條帶清晰、可辨、均勻且無拖尾現(xiàn)象，表明所提取的DNA純度高，完全能滿足SSR分析的要求(圖1)。

圖1 供試植物基因組DNA電泳檢測Fig.1 The electrophoresis of genomic DNA of tested plants

2.2 SSR 擴增結(jié)果

以4個高丹草新品系 SLCN-11、SLCN-12、SLCN-13、SLCN-14和其親本散穗高粱、黑殼蘇丹草、白殼蘇丹草、紅殼蘇丹草、棕殼蘇丹草及蒙農(nóng)青飼3號高丹草基因組DNA為模板，從200個SSR引物中篩選出條帶清晰、穩(wěn)定性好、多態(tài)性豐富的適宜引物12對(表1)，用于10個供試材料基因組DNA的PCR擴增，共得到576個SSR位點，其擴增片段長度多在200～2500 bp之間，平均每對引物擴增出48個，多態(tài)性位點509個，多態(tài)性百分率達87.3%。在12對引物中，以引物Xtxp 7擴增的總位點數(shù)和多態(tài)性位點數(shù)最少，分別為26和18個，引物Xtxp 96擴增的多態(tài)性位點百分率最高，為100%(表2)。

表1 SSR分析所用引物及其堿基序列Table 1 Primers and their nucleotide sequences used for SSR analysis

此外，每對引物擴增的SSR指紋圖均可以清晰地將10個供試材料區(qū)別開來，這可為高丹草新品系鑒定及下一步新品種育成登記和知識產(chǎn)權(quán)保護利用提供DNA分子依據(jù)(圖2～4)。

表2 供試植物SSR引物及擴增結(jié)果Table 2 SSR amplification results of tested plants

2.3 遺傳距離和聚類分析

10個供試材料間的遺傳距離(GD)變幅在0.3165 ～0.6692 之間，平均為0.5359(表3);以 GD 值0.50為基準，10個材料大體分為5類:蒙農(nóng)青飼3號、散穗高粱、SLCN-11、SLCN-12、SLCN-13 為一類;SLCN-14、棕殼蘇丹草為一類;白殼蘇丹草、黑殼蘇丹草、紅殼蘇丹草各單獨為一類(圖5)。

3 討論

植物遠緣雜交是實現(xiàn)不同物種間基因交流和創(chuàng)造新種質(zhì)(新物種、新品種)的重要途徑［17-18］。本試驗用育成登記的高丹草品種蒙農(nóng)青飼3號作對照，將散穗高粱與黑殼蘇丹草、白殼蘇丹草、紅殼蘇丹草和棕殼蘇丹草種間遠緣雜交獲得的4個低氰含量高丹草新品系SLCN-11、SLCN-12、SLCN-13、SLCN-14［9-10］和其親本間的遺傳差異及親緣關(guān)系進行SSR分析顯示，各供試材料間的遺傳距離(GD值)平均為0.5359，遺傳差異較大;10個材料聚為3類，其中在第1類的5個材料中，包含了3個母本遺傳背景均為散穗高粱的新品系SLCN-11、SLCN-12和SLCN-13，新品系SLCN-14與其沒有雜交關(guān)系的棕殼蘇丹草聚在一起，另外3個父本材料黑殼蘇丹草、白殼蘇丹草和紅殼蘇丹草各單獨為一類，即部分遺傳背景相同或不同的雜交新品系并沒有表現(xiàn)出明顯的聚類規(guī)則。這說明高粱和蘇丹草種間雜交育成的新品系實現(xiàn)了親本間基因的復雜交流，打亂了其親本原有的基因次序，組合形成了新的基因型，這可能是高丹草雜交新品系雜種優(yōu)勢強的重要分子依據(jù)。

圖2 引物xtxp61的SSR指紋圖Fig.2 SSR fingerprint amplified by the primers xtxp61

圖3 引物xtxp69的SSR指紋圖Fig.3 SSR fingerprint amplified by the primers xtxp69

圖4 引物ZCT339的SSR指紋圖Fig.4 SSR fingerprint amplified by the primers ZCT339

表3 供試植物的遺傳距離矩陣Table 3 The genetic distance matrix of tested plants

由于高丹草目前還沒有開發(fā)出SSR引物，若單獨開發(fā)成本高，故本試驗從網(wǎng)上公布 (http://algodon.tamu.edu/sorghumdb.html)的200個普通高粱(近源同屬植物)的SSR引物中，篩選出多態(tài)性豐富、條帶穩(wěn)定的12對引物進行了PCR擴增和位點分析，由于這些引物在普通高粱上擴增的SSR位點數(shù)目等表現(xiàn)情況目前還未見有研究報道，尚難與本試驗結(jié)果進行比對，但本試驗所用的母本材料散穗高粱是高粱屬的一種，從12對引物擴增的電泳圖片可知，由于引物不同其位點數(shù)不同，總體看散穗高粱的SSR位點數(shù)較多，它們與其余9個供試材料的SSR位點數(shù)和條帶位置存在著一定的差異，而且每對引物擴增的SSR指紋圖均可將10個供試材料區(qū)分開來，說明同屬近緣種普通高粱的SSR引物用于高丹草新品系在DNA水平上鑒定是可行的。

本試驗采用植物基因組試劑盒提取各供試植物基因組DNA的質(zhì)量很高，但在試驗中應(yīng)注意樣品經(jīng)液氮處理后要迅速研磨成粉末狀，且要避免長時間放置研好的樣品，否則會影響DNA的提取效果，甚至導致DNA提取失敗。另外，在聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)制備過程中，加速劑TEMED應(yīng)最后加入，并迅速充分混勻、立即勻速灌膠，否則會導致同一膠板電泳速度不一致，出現(xiàn)非水平的條帶而影響試驗結(jié)果。

圖5 10個供試植物的SSR聚類圖Fig.5 The SSR dendrogram of 10 tested plants

4 結(jié)論

試驗篩選出SSR適宜引物12對，PCR擴增10個材料的基因組DNA共得到509個多態(tài)性位點，多態(tài)性百分率達87.30%。每對引物擴增的SSR指紋圖清晰、穩(wěn)定，是識別4個低氰含量高丹草新品系及其親本的重要分子依據(jù)。供試材料間的GD值變幅為0.3165～0.6692，以GD值0.50為基準，10個材料劃分為5類:蒙農(nóng)青飼3號、散穗高粱、SLCN-11、SLCN-12、SLCN-13為一類;SLCN-14、棕殼蘇丹草為一類;白殼蘇丹草、黑殼蘇丹草、紅殼蘇丹草各單獨為一類。

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