許修宏，盧欣穎，姜 虎，李洪濤，陳會(huì)海

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院，哈爾濱 150060）

添加外源菌劑對(duì)堆肥中反硝化菌多樣性的影響

許修宏1，盧欣穎1，姜 虎2，李洪濤1，陳會(huì)海1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院，哈爾濱 150060）

一氧化二氮還原酶是堆肥發(fā)酵中反硝化菌代表性的酶，可較準(zhǔn)確地反映出堆肥中反硝化菌的活動(dòng)狀態(tài)及反硝化作用狀態(tài)。文章采用PCR-DGGE方法研究堆肥中反硝化菌群落的變化，結(jié)果表明，添加菌劑的堆肥（堆肥Ⅰ和Ⅱ）中反硝化菌的數(shù)量與種類(lèi)都有所增加（尤其是在堆肥Ⅱ中）。通過(guò)對(duì)DGGE圖譜上的條帶進(jìn)行克隆測(cè)序，發(fā)現(xiàn)測(cè)序條帶多為假單胞菌。

PCR-DGGE；nosZ-F；生物多樣性

堆肥過(guò)程中的反硝化菌主要是兼厭氧和微嗜氧菌，反硝化專性厭氧菌極少。厭氧/少氧是反硝化的必要條件[1]。但近年研究表明，有些細(xì)菌可以在好氧條件下進(jìn)行反硝化反應(yīng)[2]。反硝化作用主要發(fā)生在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期[3]。

因?yàn)橐谎趸€原酶催化的是反硝化作用的最后一步，而不同反硝化菌之間nosZ基因簇變化不大[4]，因此nosZ基因也常被作為分子標(biāo)記用于檢測(cè)可進(jìn)行完全反硝化作用（終產(chǎn)物為N2）的微生物標(biāo)記。

本試驗(yàn)采用PCR-DGGE技術(shù)，對(duì)添加外源菌劑的堆肥固體發(fā)酵過(guò)程中以一氧化二氮還原酶基因?yàn)榇淼姆聪趸郝浣Y(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究，旨在明確堆肥過(guò)程中反硝化菌群落的組成及其在不同階段的變化規(guī)律，為研究堆肥中的氮素變化規(guī)律提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)計(jì)

采用主動(dòng)通風(fēng)方式進(jìn)行牛糞與稻草秸稈的固體發(fā)酵堆肥試驗(yàn)，堆肥初始C/N比為32.35，濕度為60%，試驗(yàn)地點(diǎn)為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)站。設(shè)置堆體高1 m，直徑約為1 m，呈垛形。堆肥Ⅰ在建堆之初就加入外源菌劑，而堆肥Ⅱ在建堆時(shí)加入外源菌劑的一部分，發(fā)酵進(jìn)行到第15天時(shí)加入剩余的外源菌劑。堆肥時(shí)間控制在1個(gè)月左右，每天上午9:00定時(shí)測(cè)定堆體溫度、環(huán)境溫度，第9天和第19天進(jìn)行翻堆通風(fēng)。

1.2 樣品采集及基因組總DNA的提取

試驗(yàn)分別在堆肥發(fā)酵的第0、6、9、12、15、20、30天取樣，分上、中、下層隨機(jī)取樣，分別距堆體頂端30、60、100 cm處分五點(diǎn)采集樣品，取得的樣品混合均勻，四分法保留200 g，用保鮮袋密封、-20℃冷凍保存，以備分析測(cè)定用。樣品粗DNA采用堿裂解法提取，參照文獻(xiàn)[5-7]。粗提DNA用OMEGA純化試劑盒進(jìn)行純化。

1.3 PCR-DGGE

采用通用簡(jiǎn)并引物用于氧化亞氮還原酶的片斷擴(kuò)增：

3'[6]，其中GC鉗是為滿足DGGE的溫度而加，由北京華大基因合成。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?/p>

94℃，3 min；94℃，1 min，56.5℃，1 min，72℃，1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃，10 min。PCR反應(yīng)體系為無(wú)菌雙蒸水6.8 μL，2×PCR反應(yīng)緩沖液12.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTP溶液2.5 μL，10 mmol·L-1引物NosZ-F、Nos-1622RGC各0.1 μL，Taq酶0.5個(gè)單位，純化后的樣品DNA為模板0.5 μL，反應(yīng)體系總體積25 μL。

DGGE采用8%聚丙烯酰胺凝膠，其中尿素濃度40%～70%。電泳采用D-code DGGE系統(tǒng)（Bio-Rad），電泳緩沖液為1×TAE，在130 V固定電壓下電泳15～16 h，進(jìn)行硝酸銀染色。

1.4DGGE數(shù)據(jù)多樣性分析

多樣性指數(shù)可采用Shannon-Weaver指數(shù)表示，Shannon-Weaver指數(shù)由下式計(jì)算：式中，Dsh為Shannon-Weaver指數(shù)；Pi為第i個(gè)DGGE條帶出現(xiàn)概率；Ni為第i個(gè)RAPD條帶擴(kuò)增量；N為土壤微生物群落DNA的DGGE條帶擴(kuò)增總量微生物多樣性指數(shù)是度量生物多樣性高低及空間分布特征的數(shù)值指標(biāo)。分析軟件為T(mén)anon GIS凝膠成像系統(tǒng)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 堆肥過(guò)程中溫度的變化

三個(gè)處理的堆體溫度變化趨勢(shì)相同，都經(jīng)歷升溫期、高溫期、降溫期和腐熟期四個(gè)過(guò)程，其中0～14 d為堆肥一次發(fā)酵時(shí)期，15～31 d為堆肥二次發(fā)酵期。堆肥Ⅰ和堆肥Ⅱ均在3 d使堆溫升至50℃以上，而堆肥CK在第5天達(dá)到50℃以上，此時(shí)期為堆肥升溫期。其中堆肥Ⅰ和堆肥Ⅱ在第5天達(dá)到最高溫度分別為69和70℃，堆肥CK在第8天達(dá)到最高溫度65.5℃?？梢?jiàn)，接種微生物促進(jìn)最初堆料中微生物大量繁殖，使堆溫迅速升至理想高度。堆肥Ⅰ和堆肥Ⅱ的高溫期（大于50℃）均維持23～24 d，而堆肥CK維持13 d，堆肥Ⅰ和Ⅱ溫度變化基本一致，說(shuō)明接種時(shí)間的差異對(duì)堆肥溫度沒(méi)有太大影響；然而，在14～22 d時(shí)間段內(nèi)堆體Ⅰ的溫度顯著高于堆體Ⅱ，這可能是由于二次發(fā)酵階段添加的FLD導(dǎo)致生物活性的提高從而使堆體溫度上升。接種菌劑后，堆體溫度上升要快于自然堆肥且最高溫度高于自然堆肥，可能的原因是，接種外源微生物后提高堆肥初期微生物的數(shù)量，縮短堆肥化進(jìn)入高溫期的時(shí)間，有對(duì)堆肥加速啟動(dòng)的作用；之后開(kāi)始逐漸降溫，當(dāng)堆肥化進(jìn)行到25 d，堆體溫度緩慢下降，不再有明顯變化，說(shuō)明堆肥化已基本進(jìn)入腐熟階段。接種菌劑后高溫期持續(xù)時(shí)間比自然堆肥長(zhǎng)，說(shuō)明接種菌劑后的堆體中微生物活動(dòng)劇烈，由于微生物活動(dòng)產(chǎn)生的熱量持續(xù)時(shí)間久，可更有效殺死堆肥中的病原微生物，有利于堆肥化腐熟和無(wú)害化。

2.2PCR-DGGE分析

2.2.1 基因組總DNA

堆肥細(xì)菌基因組DNA長(zhǎng)度大于23.1 kb，均以獲得較完整的基因組DNA片段，但是提取結(jié)果有拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明片段中還有大量雜質(zhì)，例如腐殖酸類(lèi)物質(zhì)[8]。為不影響后續(xù)的PCR反應(yīng)，需要對(duì)粗提DNA進(jìn)行純化。本試驗(yàn)采用OMEGA凝膠回收試劑盒對(duì)基因組DNA進(jìn)行純化，擴(kuò)增得目的片段大約450 bp（見(jiàn)圖1）。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Results of PCR amplification

2.2.2 DGGE圖譜分析

DGGE結(jié)果顯示接種處理的堆肥Ⅰ和Ⅱ中的代表反硝化菌的條帶數(shù)量多于自然堆肥（見(jiàn)圖2）。切膠后測(cè)序顯示，條帶A與Bacillus subtilis（枯草芽孢桿菌）相似度最高，可以達(dá)到99%，條帶B和C都與Pseudomonas（假單胞菌屬）最相似，條帶D是Streptomyces（鏈球菌屬），條帶E、F均是未知菌屬，條帶G與P.stutzeri（斯氏假單胞菌）最相似，條帶H屬于Corynebacterium（棒狀桿菌屬），條帶I是P.aeruginosa（綠色假單胞菌）。

2.2.2.1 DGGE相似性比較

本試驗(yàn)根據(jù)戴斯系數(shù)（Dice coefficient）[9]法計(jì)算各樣品間相似度矩陣（見(jiàn)表1、2和3）發(fā)現(xiàn)，各泳道之間的條帶相似性不高，并且呈現(xiàn)高低變化不均的趨勢(shì)。表1、2和3分別為堆肥Ⅰ、Ⅱ和自然堆肥的DGGE圖譜條帶相似性分析表。表1中，堆肥第6天和第30天之間（見(jiàn)泳道2和7）的Cs值最低，為27.3%，第12天和15天之間（見(jiàn)泳道4、5）的Cs值最高，達(dá)69.5%；在表2中，堆肥第6天和第15天之間（見(jiàn)泳道9和12）的Cs值最低，為45.5%，第0天和9天之間（見(jiàn)泳道8、11）的Cs值最高，達(dá)78.8%；由表3可知，堆肥第15天和第30天之間（見(jiàn)泳道19和21）的Cs值最低，為28.3%，第9天和30天之間（見(jiàn)泳道17、21）的Cs值最高，達(dá)51.7%；三個(gè)堆肥處理的Cs值，取樣時(shí)間越接近，DGGE條帶相似性越高；取樣時(shí)間越遠(yuǎn)，相似性越低。高溫過(guò)程微生物群落演替迅速，每3 d取樣一次進(jìn)行研究，堆體中微生物組成和數(shù)量都發(fā)生明顯改變，如要研究更詳細(xì)的群落變化情況，可在堆肥初期進(jìn)行每天取樣分析。

圖2 堆肥Ⅰ、Ⅱ和自然堆肥DGGE電泳圖譜Fig.2 DGGE electrophoresis of compostⅠ,Ⅱand natural compost

2.2.2.2 DGGE聚類(lèi)分析（UPGAMA）

運(yùn)用Quantity one圖象分析軟件對(duì)DGGE指紋圖譜采用非加權(quán)算術(shù)平均法（UPGAMA）進(jìn)行聚類(lèi)分析：圖3、4和5分別為堆肥Ⅰ、堆肥Ⅱ和自然堆肥的聚類(lèi)分析圖?？煽闯鋈M堆肥處理各泳道條帶相似性普遍不高。原因可能是由于堆肥本身是一個(gè)微生物區(qū)系快速演替的過(guò)程。如圖3所示，堆肥Ⅰ中聚類(lèi)關(guān)系最近的是泳道4和5，最高0.69，泳道7與其他泳道聚類(lèi)關(guān)系最遠(yuǎn)，最大相差0.36。但總體上，相鄰泳道間的相似性較高，說(shuō)明取樣時(shí)間相隔越近，種群差異越小。由圖4可知，堆肥Ⅱ中聚類(lèi)關(guān)系最近的是泳道8和11，最高0.79，而泳道9與其他泳道聚類(lèi)關(guān)系最遠(yuǎn)，為0.53。而圖5則顯示，各泳道之間聚類(lèi)關(guān)系普遍偏低，最高的為泳道17和21，是0.52，泳道15和16聚類(lèi)關(guān)系僅次于泳道17和21，為0.51。

表1 堆肥ⅠDGGE圖譜條帶相似性分析Table 1 DGGE patterns with similarity analysis in compostⅠ

表2 堆肥ⅡDGGE圖譜條帶相似性分析Table 2 DGGE patterns with similar analysis in compost II

表3 自然堆肥DGGE圖譜條帶相似性分析Table 3 DGGE patterns with similar analysis in natural compost

圖3 堆肥ⅠDGGE聚類(lèi)分析Fig.3 DGGE cluster analysis in compostⅠ

圖4 堆肥ⅡDGGE聚類(lèi)分析Fig.4 DGGE cluster analysis in compostⅡ

圖5 自然堆肥DGGE聚類(lèi)分析Fig.5 DGGE cluster analysis in natural compost

對(duì)于三堆堆肥而言，均有說(shuō)明取樣時(shí)間越相近，堆肥中微生物群落相似性相對(duì)更高，尤以堆肥Ⅰ最為明顯。菌群經(jīng)過(guò)一段時(shí)間運(yùn)行，數(shù)量和優(yōu)勢(shì)種群增加，整個(gè)種群演替過(guò)程中既存在原有種屬消亡，也有新種屬增長(zhǎng)。群落相似性隨著運(yùn)行時(shí)間的延長(zhǎng)呈高低相間態(tài)勢(shì)，最終形成穩(wěn)定的群落類(lèi)型。

2.2.2.3 DGGE多樣性分析

由圖6可知，自然堆肥在堆肥升溫期及高溫期的微生物多樣性呈先增加后減少趨勢(shì)，進(jìn)入二次發(fā)酵后，其多樣性又有所增加，最終趨于平穩(wěn)。而堆肥Ⅰ的微生物多樣性在一次發(fā)酵，即0～14 d內(nèi)變化不大，應(yīng)該是由于最初添加菌劑使堆肥中分解纖維素的菌群增加，從而使堆肥中可利用的有效碳素增加導(dǎo)致。而進(jìn)入二次發(fā)酵后，微生物多樣性呈先減少后增加而后再減少的狀態(tài)，與自然堆肥發(fā)酵的一次發(fā)酵類(lèi)似，應(yīng)該與堆肥經(jīng)過(guò)高溫期，微生物群落發(fā)生迅速演替有關(guān)。對(duì)于堆肥Ⅱ而言，其微生物多樣性沒(méi)有明顯變化，但是數(shù)值較高顯示，微生物種類(lèi)極其豐富，群落演替迅速，而且在二次發(fā)酵時(shí)，再次添加菌劑更是成為其如此表現(xiàn)的一個(gè)重要原因。

圖6 堆肥Ⅰ、Ⅱ和自然堆肥微生物多樣性指數(shù)Fig.6 CompostⅠ,Ⅱand natural compost microbial diversity index

3 討論與結(jié)論

硝化過(guò)程和反硝化過(guò)程是自然界中氮素循環(huán)的重要過(guò)程，對(duì)氮素的轉(zhuǎn)化和分布起重要作用。堆肥中的反硝化作用一般發(fā)生在堆肥過(guò)程的中后期，這時(shí)堆肥中已積累一定量的硝酸鹽，且堆肥中溫度已從高溫轉(zhuǎn)換為中溫，無(wú)論從營(yíng)養(yǎng)要素角度還是從環(huán)境條件上都適合反硝化細(xì)菌生長(zhǎng)[5]。反硝化作用結(jié)果會(huì)導(dǎo)致堆肥中硝酸鹽被還原，同時(shí)釋放出氮?dú)夂脱趸瘉喌?，是堆肥氮素通過(guò)氣態(tài)方式回歸自然的重要途徑[10]。從資源利用的角度看，反硝化過(guò)程會(huì)造成資源浪費(fèi)（減少堆肥中氮素含量）。從生態(tài)保護(hù)的角度看，反硝化作用會(huì)造成環(huán)境污染、加劇溫室效應(yīng)。因此，控制或減少反硝化過(guò)程對(duì)于氮素資源的利用和減少溫室氣體排放均具有實(shí)際意義，成為堆肥技術(shù)重要組成部分。本文從分子水平上反應(yīng)驅(qū)動(dòng)反硝化過(guò)程反硝化菌的多態(tài)性變化，可為堆肥控氮技術(shù)的研發(fā)和堆肥氮素循環(huán)研究提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

反硝化菌生長(zhǎng)速度較慢，傳統(tǒng)方法分離培養(yǎng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且有部分反硝化菌難于人工培養(yǎng)。因此，如何能借助生物技術(shù)快速研究反硝化菌是研究反硝化作用的關(guān)鍵。本研究利用一氧化二氮還原酶基因[4]（nosZ基因），通過(guò)PCR-DGGE技術(shù)擴(kuò)增得到堆肥中的反硝化菌群，并對(duì)其多態(tài)性進(jìn)行研究，為堆肥中反硝化菌群的研究提供技術(shù)途徑。

本研究中，三個(gè)處理的堆體溫度變化趨勢(shì)相同，都經(jīng)歷升溫期、高溫期、降溫期和腐熟期四個(gè)過(guò)程，表明各堆肥處理均完成了堆肥的各階段，具有一定代表性[10]。隨著堆肥過(guò)程進(jìn)行，自然堆肥在堆肥升溫期及高溫期微生物多樣性呈先增加后減少趨勢(shì)，進(jìn)入二次發(fā)酵后，其多樣性又有所增加，最終趨于平穩(wěn)。而堆肥Ⅰ在一次發(fā)酵期間，微生物多樣性變化不大，二次發(fā)酵變化與自然堆肥的一次發(fā)酵變化類(lèi)似。堆肥Ⅱ的微生物多樣性一直變化不大，但數(shù)值較高。通過(guò)對(duì)DGGE圖譜的條帶進(jìn)行克隆測(cè)序，發(fā)現(xiàn)測(cè)序條帶多為假單胞菌屬。

[1]殷士學(xué),陳麗敏.土壤中硝化、反硝化微生物的研究進(jìn)展[J].土壤學(xué)報(bào),2002,39(6):116-124.

[2]龍?chǎng)?陳存社,汪萍,等.一株好氧反硝化細(xì)菌的分離與鑒定[J].中國(guó)釀造,2006(8):28-30.

[3]劉晶晶,汪蘋(píng),王歡.一株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的脫氮性能研究[J].環(huán)境科學(xué)研究,2009,21(3):121-125.

[4]郭麗蕓,時(shí)飛,楊柳燕.反硝化菌功能基因及其分子生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào),2011,38(4):583-590.

[5]Bishop P L Godfrey C.Nitrogen transformations during sludge composting[J].Biocycle,1983(5):34-39.

[6]Throb?ck I N,Enwall K,Jarvis A,et al.Reassessing PCR primers targeting nirS,nirK and nosZ genes for community surveys of denitrifying bacteria with DGGE[J].FEMS Microbiol Ecol,2004, 49:401-417.

[7]皮廣潔,唐書(shū)源.農(nóng)業(yè)資源環(huán)境監(jiān)測(cè)原理與方法[M].成都:成都科技大學(xué)出版社,1998.

[8] 付麗麗.應(yīng)用16SrDNA序列分析對(duì)礫石接觸氧化反應(yīng)器中細(xì)菌多樣性[J].科技導(dǎo)報(bào),2010,28(3):51-54.

[9]石鵬君,孟昆,伍寧豐,等.新疆一號(hào)冰川土壤細(xì)菌多樣性的研究[J].微生物學(xué)通報(bào),2006,33(4):58-63.

[10]Zeng G M,Zhang J C,Chen Y N.Relative contributions of archaea and bacteria to microbial ammonia oxidation differ under different conditions during agricultural waste composting[J].Bioresource Technology,2011,102:9026-9032.

Effect of inoculant on diversity of denitrifying bacteria in compostingXU

Xiuhong1,LU Xinying1,JIANG Hu2,LI Hongtao1,CHEN Huihai1(1.School of Resources and Environmental Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Heilongjiang Provincial Environment Protection Academy,Harbin 150060,China)

Nitrous oxide reductase is the representative of denitrifying bacteria accurately reflecting the state of the organisms and denitrification in compost.In this study,PCR-DGGE was used to study the structure and diversity of nitrous oxide reductase bacteria community in compost.The results showed that the number and species of denitrifying bacteria increased in compost(compostⅠandⅡ,especially in compostⅡ)inoculated with exogenous organisms.The cloning and sequencing of the DGGE bands revealed that they were affiliated toPseudomonas.

PCR-DGGE;nosZ-F;bio-diversity

S141.4

A

1005-9369（2014）03-0091-06

時(shí)間2014-3-20 17:49:00 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140320.1749.007.html

許修宏,盧欣穎,姜虎,等.添加外源菌劑對(duì)堆肥中反硝化菌多樣性的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(3):91-96.

Xu Xiuhong,Lu Xinying,Jiang Hu,et al.Effect of inoculant on diversity of denitrifying bacteria in composting[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(3):91-96.(in Chinese with English abstract)

2012-03-28

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31272484，31372351）

許修宏（1968-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)微生物。E-mail:xuxiuhong@neau.edu.cn