李春艷，吳志洋，馮麗萍，熊明華，成小松

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030；2.淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北 235000；3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，哈爾濱 150001）

芐嘧磺隆和丁草胺降解菌原生質(zhì)體融合條件優(yōu)化

李春艷1，吳志洋1，馮麗萍1，熊明華2，成小松3

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030；2.淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北 235000；3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，哈爾濱 150001）

研究以芐嘧磺隆降解菌Rhodococcus sp.BX2與丁草胺降解菌Acinetobacter sp.LYC-1為親本，優(yōu)化用于構(gòu)建可同時(shí)降解芐嘧磺隆與丁草胺的融合子的原生質(zhì)體融合條件。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定原生質(zhì)體融合的最佳條件：PEG4000 40%、35℃、10 min，500 μL新生磷酸鈣溶液，pH 7.5，此條件下融合頻率達(dá)到2.67× 10-7。以青霉素和磷霉素作為篩選的遺傳標(biāo)記，最終獲得在含有上述兩種除草劑的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中可穩(wěn)定繼代培養(yǎng)8代以上的融合子F1。該融合子在含有100 mg·mL-1芐嘧磺隆和100 mg·mL-1丁草胺的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，F(xiàn)1的降解率分別為65.35%和62.41%。

芐嘧磺??；丁草胺；Rhodococcus sp.BX2；Acinetobacter sp.LYC-1；原生質(zhì)體融合；條件優(yōu)化

芐嘧磺隆和丁草胺是廣泛用于稻田雜草防治的高效除草劑，長期使用會導(dǎo)致其大量沉積在土壤和水體中，破壞土壤微生物區(qū)系，降低土壤肥力，造成地下水污染[1-3]。目前，消除土壤中芐嘧磺隆和丁草胺殘留污染主要依靠微生物降解。由于土壤環(huán)境中多種農(nóng)藥殘留共存，情況紛繁復(fù)雜，從自然環(huán)境中馴化和篩選的針對芐嘧磺隆或丁草胺的土著微生物受多種環(huán)境條件限制等問題影響，存在降解譜單一或降解效率低等問題[4-6]。因此，構(gòu)建同時(shí)降解芐嘧磺隆和丁草胺的工程菌對修復(fù)被其污染土壤具有重要意義。

原生質(zhì)體融合技術(shù)因其具有致育性限制小、遺傳物質(zhì)完整傳遞、定向性好等優(yōu)點(diǎn)成為構(gòu)建多功能遺傳工程菌株的主要手段之一。Kumari等將能夠分解纖維素的Trichoderma reesei QM 9414和利用葡萄糖產(chǎn)酒精的S.cerevisiae NCIM 3288進(jìn)行融合，得到能夠?qū)V紙纖維素轉(zhuǎn)化為酒精的融合子[7]。Zhang等利用真菌、釀酒酵母和芽孢桿菌進(jìn)行原生質(zhì)體融合構(gòu)建一株能夠有效處理制藥廠污水的融合菌Xhhh[8]。田靜通過原生質(zhì)體融合獲得一株可處理含苯二甲酸、二噁烷、乙二醇等有機(jī)污染物的化纖廢水的融合菌[9]。

本研究利用原生質(zhì)體融合技術(shù)篩選能同時(shí)降解芐嘧磺隆和丁草胺的融合菌株，優(yōu)化原生質(zhì)體融合條件，并對融合菌的降解能力進(jìn)行檢測，為芐嘧磺隆、丁草胺及其混劑污染土壤的生物修復(fù)提供菌株資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

芐嘧磺隆高效降解菌Rhodococcus sp.BX2與丁草胺高效降解菌Acinetobacter sp.LYC-1由本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得并保存。BX2與LYC-1在對方的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中均不生長。

1.1.2 供試藥劑

丁草胺（原藥純度，93%）購自山東綠邦化工有限公司；芐嘧磺?。ǚ治黾?，96.74%）購自江蘇激素研究所有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑

SMM穩(wěn)定液：蔗糖171 g，MgCl2·6H2O 4.066 g，馬來酸 2.321 g，pH 7.0；新生磷酸鈣：KH2PO40.54 g，CaCl2·H2O 29.4 g分別溶于100 mL蒸餾水中，滅菌后等體積混合，現(xiàn)用現(xiàn)配；RNB再生培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母膏5 g，NaCl 5 g，葡萄糖2 g，蔗糖171 g，MgCl2·6H2O 4.066 g，1.5%聚乙烯吡咯烷酮（PVP-30），瓊脂粉1.8%，加蒸餾水至1 000 mL，pH 7.2；芐嘧磺隆無機(jī)鹽培養(yǎng)基：Na2HPO46.8 g，KH2PO43.0 g，NaCl 0.5 g，（NH4）2SO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.24 g，CaCl2·2H2O 0.02 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 7.2；丁草胺無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)液：K2HPO40.1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g，（NH4）2SO40.1 g，CaSO40.04 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH7.2。

1.2 方法

1.2.1 菌株BX2和LYC-1抗性遺傳標(biāo)記的篩選

按Kirby—Baure法進(jìn)行菌株BX2與LYC-1抗生素敏感性試驗(yàn)[10]，篩選獲得可滿足BX2（A+B-）與LYC-1（A-B+）型抗生素，針對此類組合，設(shè)置濃度梯度進(jìn)行最小濃度抑菌試驗(yàn)，依據(jù)結(jié)果確定研究中各抗生素的抑菌濃度。

1.2.2 原生質(zhì)體制備

親本Rhodococcus sp.BX2和Acinetobacter sp. LYC-1原生質(zhì)體的制備采用文獻(xiàn)[11-12]中的方法。

1.2.3 原生質(zhì)體融合及再生

1.2.3.1 原生質(zhì)體融合

將制備的親本原生質(zhì)體懸液各取1.5 mL混勻，3 000 r·min-1離心后去上清，加入0.5 mL SMM穩(wěn)定液懸浮，再加入0.5 mL新生磷酸鈣溶液，混勻后緩慢加入35℃預(yù)熱的PEG溶液，輕輕混勻，不同溫度下恒溫水浴一定時(shí)間，3 000 r·min-1離心10 min棄上清，2 mL SMM洗滌沉淀，并制成1 mL的融合菌懸浮液。

1.2.3.2 原生質(zhì)體的再生

原生質(zhì)體的再生方式為雙層平板培養(yǎng)法。將融合菌以雙層平板培養(yǎng)法接種在含有一定濃度雙抗生素的RNB再生培養(yǎng)基上，以單抗生素和無抗生素的平板為對照[13]。

1.2.4 融合菌篩選和穩(wěn)定性檢測

能夠在含有雙抗生素的再生培養(yǎng)基上生長的菌落即為融合菌株。將融合菌接種到同時(shí)含有雙抗生素及雙除草劑的固體RNB培養(yǎng)基平板中，30℃連續(xù)繼代培養(yǎng)8次以上者，即為可穩(wěn)定遺傳生長的融合菌。將穩(wěn)定融合菌分別接種在含100 mg·L-1芐嘧磺隆無機(jī)鹽培養(yǎng)液（Ⅰ）、含100 mg·L-1丁草胺無機(jī)鹽培養(yǎng)液（Ⅱ）、同時(shí)含100 mg·L-1芐嘧磺隆和100 mg·L-1丁草胺的無機(jī)鹽培養(yǎng)液中（Ⅲ），能夠在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中均生長良好的即為目的菌株。

1.2.5 菌株BX2和LYC-1原生質(zhì)體融合條件優(yōu)化

分別以PEG種類：PEG4000、PEG6000；PEG作用的pH：6.5、7.0、7.5、8.0作為單因素試驗(yàn)組，并參考單因素對融合率的影響結(jié)果，設(shè)計(jì)3個(gè)指標(biāo)，分別為PEG濃度（A）、融合溫度（B）、融合時(shí)間（C），每個(gè)指標(biāo)設(shè)計(jì)4個(gè)水平，即3因素4水平（見表1）?？紤]各因素之間可能存在交互作用。因此，選用L16（43）正交表。所擬定的正交試驗(yàn)因素與水平見表2。

表1 原生質(zhì)體融合影響因素Table 1 Influential factors of protoplast fusion

表2 正交試驗(yàn)組合表L16(43)Table 2 Combinative table of orthogonal experiment L16(43)

1.2.6 融合菌在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中對芐嘧磺隆與丁草胺的降解

將融合菌株、BX2與LYC-1以5%的接種量分別接種至50 mL終濃度均為100 mg·L-1的芐嘧磺隆和丁草胺無機(jī)鹽培養(yǎng)液中，以只含除草劑但不接菌的培養(yǎng)液作為對照，于150 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)7 d，利用液相色譜與氣相色譜[7,14]分別測定芐嘧磺隆與丁草胺的殘留量并計(jì)算芐嘧磺隆和丁草胺的降解率。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株BX2與LYC-1抗性遺傳標(biāo)記的篩選

菌株Rhodococcus sp.BX2對青霉素G敏感，對磷霉素不敏感；菌株Acinetobacter sp.LCY-1對磷霉素敏感對青霉素G不敏感。青霉素G與磷霉素符合抗性互補(bǔ)條件，選擇青霉素G和磷霉素作為篩選融合菌的抗性遺傳標(biāo)記。青霉素G對菌株BX2的最小抑制濃度為8.33 U·mL-1，磷霉素對菌株LYC-1的最小抑制濃度為200 μg·mL-1，本研究中選擇青霉素G與磷霉素的抑制濃度分別為16.67 U·mL-1和250 μg·mL-1。

2.2 菌株BX2與LYC-1原生質(zhì)體融合

2.2.1 PEG與PEG作用pH對原生質(zhì)體融合的影響

研究中選擇溫度為30℃，時(shí)間為10 min，如表3所示，在PEG4000作用下，菌株BX2與LYC-1原生質(zhì)體能夠融合，其中PEG4000濃度為40%時(shí)融合頻率較高，為1.03×10-7；菌株BX2與LYC-1 在PEG6000作用下幾乎無融合發(fā)生。

表3 PEG4000與PEG6000對原生質(zhì)體融合的影響Table 3 Effects of PEG4000 and PEG6000 on fusion frequency

如圖1所示，隨著pH升高，菌株BX2與LYC-1原生質(zhì)體融合頻率呈現(xiàn)先升高再下降趨勢，在pH 7.5時(shí)融合頻率達(dá)到最大值，為1.20×10-7。

2.2.2 PEG濃度、融合溫度及融合時(shí)間的正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)直觀分析結(jié)果見表4。當(dāng)某一因素某一水平對應(yīng)的平均值最大，說明該水平是這個(gè)因素的最佳水平，本試驗(yàn)得到菌株BX2與菌株LYC-1原生質(zhì)體融合的最佳組合條件為A2B3C3，即PEG4000濃度為40%、融合溫度為35℃、融合時(shí)間為10 min。極差大小可反映相應(yīng)因素作用的大小，極差大表明該因素是對菌株生長量影響較大的因素，3個(gè)因素對原生質(zhì)體融合影響大小順序依次為：PEG濃度>融合溫度>融合時(shí)間。

正交試驗(yàn)直觀分析法具有簡便、直觀、計(jì)算量小的特點(diǎn)，但不能估計(jì)試驗(yàn)誤差，即不能區(qū)分試驗(yàn)結(jié)果的差異是由各因素的水平變化所致，還是由試驗(yàn)的隨機(jī)波動引起，故應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件對正交試驗(yàn)進(jìn)行方差分析。由表5可知，A與B的F比大于F臨界值，得出PEG濃度與融合溫度對原生質(zhì)體融合有顯著影響。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，在最佳組合條件下兩菌株融合頻率為2.67×10-7。

2.2.3 融合菌的初步鑒定及穩(wěn)定性檢測

經(jīng)分離純化后有4株菌初步認(rèn)定為融合菌，分別標(biāo)記為F1、F2、F3與F4。

除F3外，F(xiàn)1、F2與F4均可在含有16.67 U·mL-1青霉素G、250 μg·mL-1磷霉素、100 mg·L-1芐嘧磺隆和100 mg·L-1丁草胺的再生培養(yǎng)基上穩(wěn)定繼代培養(yǎng)8代；只有F1均能夠在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的無機(jī)鹽培養(yǎng)液中生長良好，故選擇融合菌F1用于相關(guān)研究。

圖1 PEG作用pH對原生質(zhì)體融合的影響Fig.1 Effects of PEG pH on fusion frequency

表4 原生質(zhì)體融合正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiment for protoplast fusion

表5 原生質(zhì)體融合正交試驗(yàn)方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiment for protoplast fusion

2.3 融合菌F1的形態(tài)學(xué)觀察

由圖2可知，融合菌F1的形態(tài)介于兩親本之間但并不同于任一親本菌落形態(tài)，菌落呈圓形隆起，微紅、表面光滑、邊緣整齊，稍干燥，不透明，易于挑取。

2.4 F1在無機(jī)鹽培養(yǎng)液中對芐嘧磺隆與丁草胺的降解

結(jié)果見圖3。

圖2 兩親本及融合菌F1的菌落形態(tài)Fig.2 Colonial morphology of its parents and fusant F1

圖3 芐嘧磺?。˙SM）和丁草胺（Butachlor）的降解（7 d）Fig.3 Bensulfuron-methyl and butachlor degradation(7 d)

由圖3可知，融合菌F1對兩種除草劑均有一定的降解能力，當(dāng)培養(yǎng)溫度34℃，pH 7.5，接種量為5%時(shí)，菌株BX2對100 mg·L-1芐嘧磺隆的降解率為73.52%；菌株LYC-對100 mg·L-1丁草胺的降解率為50.63%；融合菌F1對100 mg·L-1芐嘧磺隆與100 mg·L-1丁草胺的降解率分別為65.35%和62.41%，所有結(jié)果誤差值在1.0%～1.2%。

3 討論

芐嘧磺隆、丁草胺及其混劑是我國目前廣泛用于稻田雜草防治的主要除草劑，長期使用引起嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。目前，尋找只含其中一種除草劑殘留的稻田幾乎不可能。因此，構(gòu)建同時(shí)降解芐嘧磺隆與丁草胺的融合菌更具有現(xiàn)實(shí)意義。

原生質(zhì)體融合會受到融合方法、融合條件等因素影響，在研究中常選擇PEG作為原生質(zhì)體融合的促融劑。PEG可使原生質(zhì)體膜電位下降，通過Ca2+離子交換而促進(jìn)凝集，PEG滲透壓導(dǎo)致的脫水作用擾亂分撒在膜表面的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)排列，提高脂質(zhì)膠粒的流動性，從而促進(jìn)原生質(zhì)體的融合[15]。在研究中，PEG4000對原生質(zhì)體融合的促進(jìn)作用最大，當(dāng)使用PEG6000作為促融劑時(shí)幾乎無融合子產(chǎn)生，其原因尚不清楚，可能與PEG的聚合度有關(guān)[16]。PEG常用濃度為30%～50%，PEG濃度過高會引起原生質(zhì)體皺縮甚至產(chǎn)生中毒現(xiàn)象，在研究中最終選擇PEG濃度為40%，該濃度能夠保證原生質(zhì)體活性的同時(shí)使融合效率最高。PEG作用時(shí)間也能影響融合效率，在一定時(shí)間范圍內(nèi)原生質(zhì)體融合率是隨著作用時(shí)間的延長而增加，但時(shí)間過長則會導(dǎo)致融合率下降，這可能是由于PEG毒害作用或是PEG使原生質(zhì)體脫水失活，所以本研究中，原生體融合最佳時(shí)間選擇為10 min。研究最終確定原生質(zhì)體最佳融合條件為PEG4000的濃度為40%，融合時(shí)間為10 min。

原生質(zhì)體融合過程中，可能發(fā)生親株內(nèi)或親株間的原生質(zhì)體融合，即產(chǎn)生所謂的同源或異源融合菌，這些都可能在基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上形成菌落。菌株BX2與LYC-1形態(tài)差異較大，對抗生素耐藥性不同。本研究綜合使用形態(tài)學(xué)觀察、抗藥性標(biāo)記及底物利用能力篩選融合菌，獲得一株符合條件的融合菌F1。為避免芐嘧磺隆與丁草胺代謝小分子的相互影響以及萃取、檢測中兩種除草劑相互影響造成誤差，采用分開測定的方法檢測親本與融合菌F1對芐嘧磺隆與丁草胺的降解情況。經(jīng)測定，融合菌F1對芐嘧磺隆與丁草胺的降解率均在60%以上，融合菌F1對兩種除草劑均有較好的降解能力。融合菌F1與兩親本相比，其對相應(yīng)除草劑的降解率均低于親本，但F1能夠在同時(shí)含有這兩種除草劑的環(huán)境中生長良好，而兩親本卻只能在含有單一除草劑的環(huán)境中生長，在同時(shí)含有兩種除草劑的環(huán)境中不能夠生長，故F1與兩親本相比有更好的應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

a.通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定親本Rhodococcussp.BX2和Acinetobactersp.LYC-1原生質(zhì)體融合最佳條件為：PEG4000 pH 7.5的條件下，PEG4000濃度為40%、融合溫度為35℃、融合時(shí)間為10 min、新生磷酸鈣溶液0.5 mL，此條件下，融合頻率達(dá)2.67×10-7。

b.以青霉素G 16.67 U·mL-1、磷霉素250 μg·mL-1作為遺傳標(biāo)記篩選融合菌，最終獲得可在含有雙抗生素、雙除草劑培養(yǎng)基中穩(wěn)定繼代培養(yǎng)8代以上的融合菌一株，命名為F1。融合菌菌落形態(tài)特征介于兩親本之間。

c.F1以5%的接種量、34℃、培養(yǎng)基初始pH 7.5的條件下，在分別含100 mg·L-1芐嘧磺隆與丁草胺的無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)液中培養(yǎng)7 d后，對芐嘧磺隆與丁草胺降解率分別為65.35%和62.41%。。

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Optimization of protoplast fusion conditions of bacteria able to de-grade bensulfuron-methyl and butachlor

LI Chunyan1,WU Zhiyang1,FENG Liping1,XIONG Minghua2,CHENGXiaosong3(1.Schoolof ResourcesandEnvironmental Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.School of Life Science, Huaibei Normal University,Huaibei Anhui 235000,China;3.School of First Clinical Medicine, Harbin Medical University,Harbin 150001,China)

In this study,functional fusants with dual functions to simultaneously degrade bensulfuron-methyl and butachlor were constructed through protoplast fusion ofRhodococcussp.BX2 andAcinetobactersp.LYC-1.The protoplast fusion condition was optimized and finally the fusion frequency reached to 2.67×10-7under the following condition:40%of PEG4000,10 min,35℃,500 μL of freshly-prepared calcium phosphate,pH 7.5.The fusant F1 was obtained with the use of penicillin G and fosfomycin as selection markers and determined to be able to pass more than eight generations stablely on the plates containing bensulfuron-methyl and butachlor.The fusant F1 had respective high degradation rate of 65.35%BSM and 62.41%butachlor in mineral medium supplemented by BSM 100 mg·L-1and butachlor 100 mg·L-1.

bensulfuron-methyl;butachlor;Rhodococcussp.BX2；Acinetobactersp.LYC-1;protoplast fusion;optimization condition

S482；Q813.2

A

1005-9369（2014）03-0079-06

時(shí)間2014-3-21 10:06:00 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140321.1006.011.html

李春艷,吳志洋,馮麗萍,等.芐嘧磺隆和丁草胺降解菌原生質(zhì)體融合條件優(yōu)化[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(3):79-84.

Li Chunyan,Wu Zhiyang,Feng Liping,et al.Optimization of protoplast fusion conditions of bacteria able to degrade bensuluronmethyl and butachlor[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(3):79-84.(in Chinese with English abstract)

2012-12-21

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41271504）

李春艷（1970-），女，教授，博士，研究方向?yàn)槲廴经h(huán)境生物修復(fù)。E-mail:chunyanli@neau.edu.cn