焦 洋，何厚龍，柳華貴，鐘衛(wèi)鴻

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州310032）

尼古?。╪icotine），又名煙堿，廣泛存在于茄科（Solanaceae）植物中。作為一種生物堿，尼古丁含量占煙草植物生物堿總量的95%，是煙草的重要成分，也是一種環(huán)境有毒物質(zhì)。尼古丁易溶于醇、氯仿及石油醚等有機(jī)溶劑，是具有堿性的二元堿。根據(jù)N－甲基四氫吡咯在吡啶環(huán)上位置的不同，尼古丁可分為3種立體異構(gòu)體：α－煙堿、β－煙堿和γ－煙堿，其中β－煙堿是尼古丁的主要存在形式。

一些微生物可以通過不同的代謝途徑（如吡啶途徑、吡咯途徑、脫甲基途徑等）利用尼古丁，具有研究和應(yīng)用價(jià)值。近年來，利用微生物降解尼古丁已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。作者在此對(duì)尼古丁的危害及污染來源、微生物降解途徑等進(jìn)行綜述。

1 尼古丁的危害及污染來源

1.1 尼古丁的危害

尼古丁不僅對(duì)人類有致毒、致癌等副作用，而且影響土壤生態(tài)結(jié)構(gòu)，污染地下水，對(duì)土壤和環(huán)境造成嚴(yán)重污染，擾亂生態(tài)平衡。1994年，尼古丁被美國環(huán)保局正式列入有毒物質(zhì)釋放目錄（Toxics Release Inventory）［1］。大量尼古丁可以抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，造成呼吸停止，心臟麻痹。尼古丁一旦進(jìn)入人體細(xì)胞，就會(huì)變?yōu)橐环N神經(jīng)毒素，使人產(chǎn)生興奮感，長期作用會(huì)導(dǎo)致依賴性，是吸煙成癮的主要作用物質(zhì)；還可以轉(zhuǎn)化成多種具有高生物活性的物質(zhì)（如NNN、NNK、cotinine、TSNA等），顯著提高癌癥（如肺癌等）的并發(fā)率［2］。

尼古丁在細(xì)胞水平上的影響還有：抑制細(xì)胞增殖和凋亡，造成姐妹染色單體交換和畸變，導(dǎo)致心臟休克蛋白表達(dá)加強(qiáng)［3］。流行病學(xué)研究表明，在妊娠期內(nèi)，尼古丁的暴露可以顯著提高“嬰兒猝死綜合癥”（sudden infant death syndrome，SIDS）的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［4］。尼古丁暴露可以對(duì)胎兒的生長發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重影響，包括直接的致畸效應(yīng)以及出生后表現(xiàn)出來的“印記”效應(yīng)（妊娠期內(nèi)，在胎兒器官和系統(tǒng)發(fā)育的敏感期內(nèi)，某些發(fā)生在胎兒生長環(huán)境中的改變可能會(huì)對(duì)胎兒留下永久性的“印記”，在其出生后會(huì)影響內(nèi)分泌系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)、心腦血管等的正常發(fā)育）［5］。

1.2 尼古丁污染的來源

自然環(huán)境和人類生活環(huán)境中尼古丁的污染主要來源于煙草及其廢棄物、煙堿型農(nóng)藥、尼古丁橡膠、尼古丁藥劑等［6］，尤其以煙草廢棄物污染最為嚴(yán)重。

我國是世界上最大的煙草生產(chǎn)國和消費(fèi)國，煙草產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的35%，卷煙產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的32%，煙民數(shù)量占世界總量的20%，均位居世界第一，2007年，全行業(yè)利稅達(dá)3 880億元［7］。在巨大消費(fèi)市場下，煙草行業(yè)逐步發(fā)展成為我國支柱產(chǎn)業(yè)之一，在國民經(jīng)濟(jì)中占有很高的比例。然而，在煙草行業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，由于煙草大規(guī)模廣泛種植、大量煙草制品的后期加工以及含尼古丁廢棄物的不合理排放，給自然環(huán)境和人類健康帶來巨大隱患。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年煙葉總產(chǎn)量約450萬～500萬t，其中約90萬～150萬t煙草制品下腳料被廢棄。這些煙草廢棄物中尼古丁平均含量高達(dá)18g·（kg干重）－1，是歐盟規(guī)定有毒有害煙草廢棄物中尼古丁含量控制標(biāo)準(zhǔn)的36倍［8］。由于尼古丁具有極好的水溶性，在自然環(huán)境中不易分解，所以很容易造成水體的污染，甚至造成地下水污染，對(duì)自然環(huán)境和人類健康帶來巨大威脅。因此，尼古丁污染處理受到研究人員的高度重視，微生物降解尼古丁也成為研究的熱點(diǎn)。

2 尼古丁的降解

尼古丁含量是影響卷煙制品品質(zhì)的重要因素，含量過高會(huì)導(dǎo)致煙氣的刺激性強(qiáng)、卷煙吸味差、安全性差。目前，在煙草生產(chǎn)期間和后期加工過程中嚴(yán)格控制尼古丁的含量是減輕尼古丁污染的主要途徑，其方法主要有物理化學(xué)法和微生物降解法。

物理化學(xué)法成本較高、副產(chǎn)物多，影響煙草其它組分。如袁淑霞等［9］研究發(fā)現(xiàn)，添加HNO3改性活性炭可吸附煙氣中的尼古??；王怡紅等［10］研究發(fā)現(xiàn)，NaCl等無機(jī)鹽對(duì)卷煙中的尼古丁具有去除效果；高興齋等［11］用氣浮加過濾，在調(diào)節(jié)池加以射流曝氣，對(duì)卷煙廠廢水進(jìn)行處理，污染物去除率高達(dá)85%～95%，達(dá)到了廢水排放標(biāo)準(zhǔn)。

微生物降解法選擇性高、副產(chǎn)物少、高效、經(jīng)濟(jì)且易操作，微生物資源豐富，代謝具有多樣性，所以得到了越來越多的關(guān)注。

3 尼古丁降解微生物

早在1927年，Batham［12］在土壤中加入尼古丁后發(fā)現(xiàn)硝酸鹽的含量有所增加，他認(rèn)為這是土壤微生物作用的結(jié)果，這是最早的關(guān)于尼古丁降解菌的報(bào)道。此后，越來越多的尼古丁降解菌被發(fā)現(xiàn)，包括細(xì)菌、放線菌及真菌。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的可降解尼古丁的微生物主要有：細(xì)菌中的假單胞菌屬（如Pseudomonas putida S16［13］、Pseudomonas putida ZUTSKD［14］）、節(jié)桿菌屬（如Arthrobacter oxidans［15］）、纖維單胞菌屬［16］（如Cellulomonas sp.）、蒼白桿菌屬［17］（如Ochrobactrum intermedium）等；放線菌中的Streptomyces platense、Streptomyces griseus等；真菌中的Cunninghamella echinulata、Aspergillus oryzae［18］等。已發(fā)現(xiàn)的尼古丁降解菌中，大部分菌株可以以尼古丁為唯一碳源、氮源和能源生長。

假單胞菌是應(yīng)用最廣泛的一類尼古丁降解微生物。最早關(guān)于降解尼古丁假單胞菌的報(bào)道是Wada等［19］在土壤中分離得到的尼古丁降解菌Pseudomonas sp.No.41，并開始對(duì)該菌株進(jìn)行代謝途徑的研究。隨 后，Pseudomonas convexa Pc1［20］、Pseudomonas putida S16［13］、Pseudomonas sp.HF－1［8］、Pseudomonas putida ZUTSKD［14］、Pseudomonas sp.Nic22［21］、Pseudomonas putida ZB－16A［22］、Pseudomonas sp.HZN6［23］、Pseudomonas sp.CS3［24］等假單胞菌屬尼古丁降解菌陸續(xù)被報(bào)道。在這些假單胞菌中，耐受尼古丁能力最強(qiáng)的是P.putida ZB－16A和P.putida S16，可耐受尼古丁濃度高達(dá)6g·L－1，其次是P.putida ZUTSKD，可耐受尼古丁濃度為5.8g·L－1，其它菌株耐受尼古丁濃度一般在4g·L－1左右。P.putida S16降解能力最強(qiáng)，13h即可將4g·L－1的尼古丁完全降解。大部分假單胞菌降解尼古丁的最適溫度為30℃、最適pH值為7.0。隨著研究的深入，越來越多的可降解尼古丁的假單胞菌被發(fā)現(xiàn)，大部分屬于Pseudomonas putida，同時(shí)也有一些新發(fā)現(xiàn)的菌種，如Pseudomonas stutzeri ZCJ［25］，該菌株降解尼古丁的最適溫度為37℃、最適pH值為7.5、耐受尼古丁濃度達(dá)4.5g·L－1，在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液會(huì)有顏色的變化。

4 微生物降解尼古丁的代謝途徑

關(guān)于微生物降解尼古丁的代謝途徑目前還處于研究階段。已報(bào)道并經(jīng)證實(shí)的途徑主要有3種：廣泛存在于假單胞菌屬（Pseudomonas）和刺孢小克汗霉菌屬（Cunninghamella echinulata）的 吡 咯 途 徑（pyrrolidine pathway）、廣泛存在于節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）的吡啶途徑（pyridine pathway）、廣泛存在于煙草植物及真菌（Pellicularia filamentosa）中的脫甲基途徑（Me pathway）［22，26－27］。

4.1 吡咯途徑（圖1）

吡咯途徑從尼古丁的吡咯烷脫氫開始，生成N－甲基麥思明（N－methymyosmine），接著水化成假氧化尼古丁（pseudooxynicotine），脫掉甲胺生成3－琥珀酰吡啶（3－succinoylpyridine，SP），SP通過羥基化生成6－羥基－3－琥珀酰吡啶（6－h(huán)ydroxy－3－succinoylpyridine，HSP），進(jìn)而生成2，5－二羥基吡啶（2，5－dihydroxy－pyridine，DHP），最后吡啶環(huán)打開，完成吡咯途徑的代謝。

4.2 吡啶途徑（圖2）

吡啶途徑從尼古丁在尼古丁脫氫酶（NDH）作用下吡啶環(huán)第6位羥基化生成6－羥基尼古?。?－h(huán)ydroxynicotine）開始，隨后在6－羥基尼古丁氧化酶（6－HNO）催化作用下生成6－羥基－N－甲基麥思明（6－h(huán)ydroxy－N－methylmyosmine），6－羥基－N－甲基麥思明在酶6－HLNO或6－HDNO的催化作用下生成［6－羥基吡啶基－（3）］－甲胺丙基酮［N－methylaminopropyl－（6－h(huán)ydroxypyridyl－3）－ketone］，而后在酮脫氫酶（KDH）催化作用下生成［2，6－二羥基吡啶基－（3）］－甲胺丙基酮［N－methylaminopropyl－（2，6－dihydroxypyridyl－3）－ketone］，隨后經(jīng)2，6－二羥基假氧化尼古丁水解酶（DHPONH）的催化生成2，6－二羥基吡啶（2，6－dihydroxypyridine）和γ－甲胺基丁酸（γ－N－methylaminobutyrate），最后γ－甲胺基丁酸經(jīng)N－甲胺基丁酸氧化酶（MABO）的催化生成γ－胺基丁酸（γ－aminobutyrate），2，6－二羥基吡啶經(jīng)2，6－二羥基吡啶－3－羥化酶（2，6－DHPH）的催化生成2，3，6－三羥基吡啶（2，3，6－trihydroxy－pyridine）。值得注意的是，尼古丁代謝吡啶途徑中培養(yǎng)液經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)顏色的變化，可能是由于在代謝過程中，一些小分子的代謝中間產(chǎn)物聚合成藍(lán)色聚合物——尼古丁藍(lán)（nicotine blue）所致。

圖1 尼古丁代謝的吡咯途徑Fig.1 Pyrrolidine pathway of nicotine metabolism

圖2 尼古丁代謝的吡啶途徑Fig.2 Pyridine pathway of nicotine metabolism

4.3 脫甲基途徑

脫甲基途徑始于尼古丁吡咯烷的脫甲基化，先生成去甲基尼古?。╪ornicotine），然后沿著去甲基尼古丁的代謝途徑進(jìn)一步代謝降解。

4.4 其它途徑

隨著尼古丁代謝途徑研究的不斷深入，一些新的尼古丁代謝途徑及代謝產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)。利用GC－MS分析Pseudomonas sp.ZUTSKD對(duì)尼古丁的降解產(chǎn)物，檢測到有可天寧、2，3′－二吡啶、3－（2，3，4－三氫－5－吡咯基）－吡啶和3－羧基－吡啶的生成，推斷3－（2，3，4－三氫－5－吡咯基）－吡啶是由尼古丁經(jīng)可天寧脫－CH3生成，這可能是尼古丁在Pseudomonas sp.ZUTSKD中降解代謝的初始步驟，不同于已知的微生物代謝尼古丁的途徑。因此，推測Pseudomonas sp.ZUTSKD可能有著全新的尼古丁代謝途徑［28］。

在對(duì)Pseudomonas sp.HF－1和Pseudomonas sp.Nic22尼古丁代謝中間產(chǎn)物進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)了可鐵寧、去甲基尼古丁、麥思明等，在Pseudomonas sp.HF－1代謝尼古丁產(chǎn)物中還發(fā)現(xiàn)了尼古提林，通過HPLC、GC－MS、NMR和FTIR分析Pseudomonas plecoglossicida TND35降解尼古丁產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)了3種新的中間產(chǎn)物，這些均表明菌株中可能存在著其它的尼古丁代謝途徑［22，29］。

5 結(jié)語

尼古丁不僅嚴(yán)重威脅人體健康，而且破壞土壤生態(tài)結(jié)構(gòu)，擾亂生態(tài)平衡。微生物可以以尼古丁作為唯一的碳源、氮源和能源進(jìn)行生長繁殖，最終將尼古丁通過不同的代謝途徑降解成無害的物質(zhì)。細(xì)菌中的假單胞菌屬是降解尼古丁最廣泛的微生物，其降解能力和耐受能力較強(qiáng)，具有較高的研究和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。在未來的研究中，可以從酶學(xué)和分子生物學(xué)水平研究微生物代謝尼古丁的機(jī)理，找到關(guān)鍵酶及其基因，利用基因工程手段增強(qiáng)微生物對(duì)尼古丁的降解能力。

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