張曜武，丁 寧

（青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島266042）

我國東北地區(qū)紅松（Pinus koraiensis）資源豐富，其果實(shí)松子因具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和保健功能而被廣泛食用。從摘除松子后的松球鱗片中提取的松子殼多糖具有抗病毒[1－2］、抗腫瘤[3－4］、增強(qiáng)免疫[5］等多種生物活性，而多糖的活性又與其結(jié)構(gòu)組成密切相關(guān)[6］，因此有必要對(duì)其單糖組成和結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析。

作者將膜分離技術(shù)與離子交換纖維素柱層析聯(lián)用，分別得到紅松松子殼總多糖PPSPⅠ－b和其分離純化組分PPSPⅠ－1，采用氣相色譜儀測定多糖樣品的單糖組成及其物質(zhì)的量比，采用紅外光譜儀對(duì)PPSPⅠ－1的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行初步分析，擬為紅松松子殼多糖成分的深入研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

紅松松子殼，青島天元普康生物技術(shù)有限公司；DEAE－52離子交換纖維素，北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司。

鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、氯仿、吡啶、肌醇、三氟乙酸、醋酸酐、甲醇、鹽酸羥胺均為國產(chǎn)分析純試劑。

98－1－B型電子調(diào)溫電熱套；SHZ－Ⅲ型循環(huán)水真空泵；80－2B型臺(tái)式低速離心機(jī)；RE－52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)；N－300型氣相色譜儀（氫火焰離子檢測器）；FTIR－480型紅外光譜儀。

1.2 方法

1.2.1 混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備[7］

單糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化：稱取單糖標(biāo)準(zhǔn)品10mg，放入具塞試管中，加鹽酸羥胺10mg、內(nèi)標(biāo)7mg、無水吡啶0.5mL，放入90℃水浴中加熱30min并振蕩使其完全溶解，取出后冷卻至室溫，加入醋酸酐0.5mL，在90℃下繼續(xù)反應(yīng)30min進(jìn)行乙?；鋮s后加入少量甲醇，旋蒸除掉溶劑，加入氯仿1mL重新溶解。

分別稱取鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等6種單糖標(biāo)準(zhǔn)品各10mg，按上述方法進(jìn)行衍生化處理，氯仿溶解，即得混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.2 紅松松子殼多糖的提取、分離與純化

稱取一定量紅松松子殼粉末，用15倍水提取3次，每次2h，合并提取液；經(jīng)活性炭吸附、離心，再經(jīng)微濾、超濾分離純化，木瓜蛋白酶結(jié)合Sevage法脫蛋白，大孔吸附樹脂脫色，醇沉，離心，得總多糖PPSPⅠ－b。

取一定量PPSPⅠ－b溶于蒸餾水，上樣到已平衡的DEAE－52離子交換纖維素柱上，用蒸餾水洗脫，3，5－二硝基水楊酸法（DNS法）跟蹤檢測，根據(jù)洗脫曲線的主峰位合并收集液，透析，干燥，即得紅松松子殼多糖純化組分PPSPⅠ－1。

1.2.3 多糖樣品的水解和衍生化[8］

稱取紅松松子殼多糖樣品10mg，置于安瓿瓶中，加入4mol·L－1的三氟乙酸（TFA）2mL，振蕩使其溶解，充氮?dú)夥夤芎笥?10℃水解3h；取出冷卻后，將水解液減壓蒸干，然后加少量甲醇溶解，再減壓蒸干，重復(fù)上述操作4～5次以完全除盡TFA。

衍生化步驟同1.2.1。

1.2.4 色譜條件

HP－5型 毛 細(xì) 管 色 譜 柱 （30m×0.32mm，0.25 μm），載氣為N2，檢測器為FID，汽化室溫度260℃，檢測器溫度260℃；程序升溫：初溫140℃保留5min；以2℃·min－1的速率升溫至180℃，保留5min；以2℃·min－1的速率升溫至210℃，保留10min。

1.2.5 紅外光譜分析[9］

對(duì)純化組分PPSPⅠ－1進(jìn)行紅外光譜分析：取干燥的PPSPⅠ－1樣品2mg，以 KBr壓片，在4 000～400 cm－1區(qū)間進(jìn)行紅外光譜掃描。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅松松子殼多糖的單糖組成分析

混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液、紅松松子殼總多糖PPSPⅠ－b和純化組分PPSPⅠ－1的氣相色譜見圖1。

圖1 混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品（a）、PPSPⅠ－b（b）、PPSPⅠ－1（c）的氣相色譜Fig.1 The gas chromatogram of mixed monosaccharide standard（a），PPSPⅠ－b（b），PPSPⅠ－1（c）

由圖1a可知，6種標(biāo)準(zhǔn)單糖可以得到較好的分離。以肌醇為內(nèi)標(biāo)，在混合標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物中逐一加入標(biāo)準(zhǔn)單糖，根據(jù)相應(yīng)色譜峰面積的變化，可鑒定出各單糖的出峰順序依次為：鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。

由圖1b可知，PPSPⅠ－b是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等單糖組成的雜多糖，其物質(zhì)的量比為3.40∶1.40∶0.79∶7.82∶10.67∶18.35。

由圖1c可知，PPSPⅠ－1是由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等單糖組成的雜多糖，其物質(zhì)的量比為0.96∶2.30∶2.97∶10.60∶6.91。在PPSPⅠ－b和PPSPⅠ－1色譜圖保留時(shí)間為16min附近均有一個(gè)色譜峰，因缺乏相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品未能鑒別歸屬。

2.2 紅松松子殼多糖的結(jié)構(gòu)分析

純化組分PPSPⅠ－1的紅外光譜見圖2。

由圖2可知，PPSPⅠ－1在1 000～1 200cm－1、2 800～3 000cm－1、3 200～3 500cm－1區(qū)域內(nèi)均具有多糖的特征吸收峰。3 431.27cm－1處為分子間O－H伸縮振動(dòng)吸收峰；2 933.33cm－1處為C－H伸縮振動(dòng)吸收峰；1 629.58cm－1處為多糖的水合振動(dòng)吸收峰；1 452.03cm－1處是C－H 變角振動(dòng)吸收峰；1 040.48 cm－1處是吡喃糖環(huán)的醚鍵C－O－C的吸收峰，表明PPSPⅠ－1中的單糖是以吡喃糖的形式存在；806.34 cm－1處是α－端基差向異構(gòu)的C－H變角振動(dòng)吸收峰。

圖2 PPSPⅠ－1的紅外光譜Fig.2 The FTIR spectrum of PPSPⅠ－1

3 結(jié)論

采用膜分離技術(shù)對(duì)紅松松子殼熱水提取物進(jìn)行分離純化，經(jīng)脫蛋白、脫色后得到總多糖PPSPⅠ－b，經(jīng)DEAE－52離子交換纖維素柱層析分離得到純化組分PPSPⅠ－1。PPSPⅠ－b主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成；PPSPⅠ－1主要由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成；PPSPⅠ－1的紅外光譜中具有多糖特征吸收峰，顯示其中存在吡喃糖和α－構(gòu)型糖苷鍵。

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