黃瓜過(guò)氧化物酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)

胡瑞斌，李 星，王紅楊，王 潔，唐云明*

（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶市甘薯工程研究中心，三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

黃瓜過(guò)氧化物酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)

胡瑞斌，李 星，王紅楊，王 潔，唐云明*

（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶市甘薯工程研究中心，三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

新鮮的黃瓜經(jīng)勻漿、抽提、硫酸銨沉淀、CM-Sepharose 離子交換層析、Superdex-200凝膠過(guò)濾層析后獲得電泳純的過(guò)氧化物酶。該酶的比活力、回收率及純化倍數(shù)分別為64 177.67 U/mg、9.58%、61.93。該酶的分子質(zhì)量為41.15 kD，亞基分子質(zhì)量為40.21 kD。該酶的最適溫度和最適pH值分別為60 ℃和 6。在25～45 ℃及pH 5～9的范圍內(nèi)非常的穩(wěn)定。在測(cè)定條件下測(cè)得該酶的Km值為53.79 mmol/L。硫氰化鉀對(duì)該酶活力基本無(wú)影響。尿素、K+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、B a2+、Cu2+對(duì)該酶都具有激活作用且濃度至50 mmol/L時(shí)酶活力分別被激活至112%、127%、113%、128%、139%、199%、348%，然而十二烷基磺酸鈉、抗壞血酸和草酸對(duì)該酶有強(qiáng)烈的抑制作用；Zn2+、甲醇、乙醇和異丙醇對(duì)該酶有一定的抑制作用。

黃瓜；過(guò)氧化物酶；分離純化；性質(zhì)

過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）是由單一肽鏈與卟啉構(gòu)成的血紅素蛋白。它作為一種氧化還原酶，普遍存在于各種動(dòng)植物和微生物體內(nèi)。它具有參與植物體內(nèi)活性氧的代謝[1]、吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）的降解[2]、木質(zhì)素的合成[3]等生理功能。該酶在食品檢測(cè)[4]、酶聯(lián)免疫分析[5]、生物傳感器[6]、污水處理[7]、醫(yī)療[8]等方面具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)今，該酶的商品化生產(chǎn)主要來(lái)源于辣根，但其價(jià)格比較昂貴。黃瓜作為一種四季常見(jiàn)的綠色蔬菜，分布于我國(guó)各地，具有美容、藥用等價(jià)值并含有多種營(yíng)養(yǎng)成分[9]，且黃瓜廉價(jià)易得，黃瓜POD的酶學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、酶活力較高，目前未見(jiàn)黃瓜POD的分離純化的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以黃瓜為材料對(duì)POD進(jìn)行分離純化并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，有利于黃瓜的綜合開(kāi)發(fā)利用，為該酶提供了新的獲取途徑，為該酶為進(jìn)一步研究和應(yīng)用于工業(yè)、環(huán)境及生物醫(yī)學(xué) 領(lǐng)域提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以新鮮的黃瓜為提取過(guò)氧化物酶的材料，購(gòu)買于重慶市北碚區(qū)菜市場(chǎng)。

1.2 試劑

CM-Sepharose、Superdex-200、凝膠過(guò)濾層析分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品、蛋白質(zhì)電泳標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)GE Healthcare 公司；考馬斯亮蘭G-250、R-250 美國(guó)Bio-Rad公司；三羥甲基氨基甲烷 香港Farco公司；藍(lán)色葡聚糖-2000、丙烯酰胺、甲叉-雙丙烯酰胺 瑞士Fluka公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

AKTA prime plus蛋白質(zhì)純化系統(tǒng) 美國(guó)GE公司；Mill-Q plus超純水儀 美國(guó)Millipore公司；精密電子天平 瑞士Mettler-Toledo公司；UV-2550型分光光度計(jì)、蛋白核酸定量?jī)x 日本島津公司；冷凍干燥儀 德國(guó)Uni Equip公司；垂直板電泳槽和電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀公司；PHS-32W微電路pH計(jì) 上海理達(dá)儀器廠。

1.4 方法

1.4.1 粗酶液的提取

取新鮮黃瓜，用雙蒸水沖洗干凈、擦干，去籽去瓤，稱重剪碎，然后按1∶1（m/V）比例加入4℃預(yù)冷的0.05 mol/L磷酸鹽提取緩沖液（pH7.2）勻漿（12 000 r/min、15 s，間隔5 s）后，放置于4 ℃冰箱靜置抽提2 h，4 ℃、12 000 r/min離心60 min，取上清液即得粗酶液。

1.4.2 硫酸銨分級(jí)沉淀

向粗酶液中加入硫酸銨粉末至35%飽和度，4 ℃鹽析2 h，12 000 r/min離心35 min收集上清液；加入硫酸銨粉末至70%飽和度，4 ℃鹽析2 h，6 000 r/min離心35 min，收集沉淀；加入0.05 mol/L磷酸鹽提取緩沖液（pH7.2）至沉淀完全溶解，4 ℃用0.05 mol/L pH 7.2磷酸鹽提取緩沖液透析過(guò)夜即得初酶液。

1.4.3 CM-Sepharose層析

經(jīng)0.05 mol/L pH 5的醋酸緩沖液平衡層析柱后，初酶液加樣10 mL，用0～1 mol/L的NaCl溶液（含0.05 mol/L pH 5的醋酸緩沖液）進(jìn)行線性梯度洗脫，流速0.5 mL/min，每管收集5 mL；測(cè)定各管過(guò)氧化物酶液的活性和蛋白含量，收集活性較高的酶液透析并冷凍干燥后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 Superdex-200層析

經(jīng)0.05 mol/L pH 5醋酸緩沖液平衡層析柱后，取上述冷凍干燥好的POD用0.05 mol/L pH 5醋酸緩沖液溶解，每次加樣4 mL，用0.05 mol/L pH 5醋酸緩沖液洗脫，流速0.3 mL/min，每管收集3 mL；測(cè)定各管過(guò)氧化氫酶液的活性和蛋白含量；收集活性較高的酶液，4 ℃雙蒸水透析脫鹽冷凍干燥后，獲得過(guò)氧化物酶純品，－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5 POD活力的測(cè)定

按陳貽竹等[10]的方法測(cè)定。測(cè)定體系為3 mL，含2.775 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）、100 μL 4%愈創(chuàng)木酚和100 μL 1% H2O2。加入25 μL酶液后迅速混勻，在25 ℃立即記錄2 min內(nèi)OD470nm的變化。酶活力單位（U）定義為：在該反應(yīng)條件下，每分鐘發(fā)生光密度OD470nm改變0.01所需的酶量為1 個(gè)酶活力單位。

1.4.6 POD純度鑒定與分子質(zhì)量測(cè)定[11]

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）對(duì)該酶進(jìn)行純度鑒定，分離膠為12%，加樣量10μL。經(jīng)SDS-PAGE電泳和Superdex-200凝膠過(guò)濾層析分別測(cè)定該酶亞基分子質(zhì)量與全酶分子質(zhì)量。

Superdex-200凝膠過(guò)濾層析柱用醋酸緩沖液平衡過(guò)夜，流速0.3mL/min，將藍(lán)色葡聚糖2000上平衡好的該層析柱，其柱床體積為Vt，測(cè)定其外水體積（Vo)；將已知分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)上樣該層析柱，測(cè)定每一標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的洗脫體積（Ve)并計(jì)算各自的有效分配系數(shù)（Kav），其計(jì)算公式為：Kav=（Ve－Vo)/（Vt－Vo)，然后以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)lgMr作為X軸，Kav為Y軸，制作蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。按以上方法將黃瓜過(guò)氧化物酶上該層析柱并測(cè)出其Ve和Kav，根據(jù)Kav值查標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算即得該酶的分子質(zhì)量。

1.4.7 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定

分別用紫外分光光度法與考馬斯亮藍(lán)染料法（Bradford法）[12]測(cè)定該酶的蛋白質(zhì)濃度。

1.4.8 黃瓜POD的酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

1.4.8.1 最適溫度和溫度穩(wěn)定性

分別測(cè)定在不同溫度（25～85 ℃，間隔為5 ℃)下該酶的活力（最適溫度條件下，測(cè)得的酶活力為100%）和分別將酶液放置在不同溫度（25～80 ℃，間隔為10 ℃）下，每隔60 min測(cè)定酶活力（25 ℃條件下原酶液的酶活力為100%且測(cè)定3 次取平均值），計(jì)算該酶的相對(duì)酶活力，研究其最適溫度和溫度穩(wěn)定性。

1.4.8.2 最適pH值和pH值穩(wěn)定性

分別測(cè)定不同pH值（2.2～10.0）下該酶活力以確定最適pH值；分別將酶液放置在不同的pH值（3～9，間隔為1）的緩沖液中，25 ℃每隔60 min測(cè)定該酶的活力，二者均以最適條件下測(cè)得的酶活力為100%且測(cè)定3 次取平均值，計(jì)算該酶相對(duì)酶活力，研究其最適pH值和pH值穩(wěn)定性。

1.4.8.3 米氏常數(shù)（Km）的測(cè)定

配制不同濃度的過(guò)氧化氫（10～50 mmol/L，間隔為10 mmol/L）作為底物，在測(cè)定條件下計(jì)算POD的酶活力且測(cè)定3次取平均值，用雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver-Burk法）[13]計(jì)算該酶的Km值。

1.4.8.4 部分有機(jī)溶劑對(duì)POD活性的影響

分別把甲醇、乙醇、異丙醇與醋酸緩沖液（0.05mol/L、pH 5）和酶液混勻（終體積分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、40%、50%），4 ℃放置30 min，然后在測(cè)定條件下確定該酶的活力（以不加有機(jī)溶劑時(shí)酶活力為100%且測(cè)定3 次取平均值）。

1.4.8.5 部分化合物對(duì)POD活性的影響

分別將尿素、草酸、硫氰化鉀（potassium thiocyanate，KSCN）、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）、抗壞血酸（ascorbic acid，ASA），配成100 mmol/L母液，以一定比例與醋酸緩沖液（0.05 mol/L、pH 5）和酶液混合，使得終濃度分別達(dá)到10、20、30、40、50 mmol/L，4 ℃放置30 min，然后在測(cè)定條件下確定該酶的活力（以不加化合物時(shí)酶活力為100%且測(cè)定3 次取平均值）。

1.4.8.6 部分金屬離子對(duì)POD活性的影響

分別將部分金屬離子配成100 mmol/L母液，以一定比例與醋酸緩沖液（0.05 mol/L、pH 5）和酶液混合使得終濃度分別達(dá)到10、20、30、40、50 mmol/L，4 ℃放置30 min，然后在測(cè)定酶活力（以不加金屬離子時(shí)的酶活力為100%且測(cè)定3 次取平均值）。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜POD的分離純化

黃瓜POD的粗酶液經(jīng)CM-Sepharose層析，如圖1所示，有3 個(gè)酶活力峰，推測(cè)該酶可能有3 個(gè)同工酶，收集其酶活力最高的第2個(gè)峰中的各管，經(jīng)Superdex-200層析，如圖2所示，酶活力集中在29～33管，第31管活性最高，收集活性較高的各管，透析冷凍干燥獲得該酶純品，經(jīng)SDS-PAGE電泳，為單一條帶(圖3)，說(shuō)明該酶達(dá)到了電泳純。該酶的整體分離純化結(jié)果如表1所示，可知黃瓜POD純品的純化倍數(shù)為61.93，回收率為9.58%，酶比活力達(dá)到64177.67U/mg。

圖1 黃瓜POD的CM-Sepharose離子交換層析Fig.1 CM-Sepharose ion-exchange chromatography of POD from cucumber

圖2 黃瓜POD的Superdex-200凝膠過(guò)濾層析Fig.2 Superdex-200 gel filtration chromatography of POD from cucumber

表1 黃瓜POD的分離純化Table1 Isolation and purification of POD from cucumber

2.2 過(guò)氧化物酶的分子質(zhì)量

經(jīng)SDS-PAGE后獲得電泳純的單一條帶，測(cè)得酶的亞基分子質(zhì)量為40.21 kD（圖3），經(jīng)Superdex-200凝膠過(guò)濾層析測(cè)得該酶的分子質(zhì)量為41.15 kD，由此可以判定黃瓜過(guò)氧化物酶由單一亞基構(gòu)成。

圖3 黃瓜POD的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE of purified POD from cucumber

2.3 POD的部分酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 最適溫度和溫度穩(wěn)定性

在不同溫度下測(cè)定黃瓜過(guò)氧化物酶的活力如圖4所示，黃瓜過(guò)氧化物酶的最適溫度為60 ℃，該酶作用溫度范圍較廣，在30～70 ℃范圍內(nèi)該酶的活力均保持在80%以上，超出此溫度，酶活力迅速下降，85 ℃時(shí)該酶活力仍保留39%。從圖5可知，該酶在25～45 ℃范圍內(nèi)的熱穩(wěn)定性較好，保溫5 h酶活力均保持在90%以上；55 ℃保溫5 h后酶活力保留49%；高于65 ℃時(shí)，酶活力下降迅速；75 ℃保溫1 h后，酶蛋白基本完全失活。

圖4 溫度對(duì)黃瓜POD活力的影響Fig.4 Effect of temperatures on the activity of POD from cucumber

圖5 黃瓜POD的熱穩(wěn)定性Fig.5 Thermal stability of POD from cucumber

2.3.2 最適作用pH值和pH值穩(wěn)定性

圖6 pH值對(duì)黃瓜POD活性的影響Fig.6 Effect of pH on the activity of POD from cucumber

如圖6所示，黃瓜過(guò)氧化物酶的最適pH值為6，在pH 5～7范圍內(nèi)該酶的活力較高，超出此范圍酶活力迅速下降。從圖7可知，該酶在pH 5～9范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，保溫5 h其活力均保持在85%以上，在pH 3～4保溫5 h酶活力還保持在38%以上，表明該酶可以耐受較大范圍的pH值，有利于該酶在不同的pH值環(huán)境下發(fā)揮作用。

圖7 黃瓜POD的pH值穩(wěn)定性Fig.7 pH stability of POD from cucumber

2.3.3 米氏常數(shù)（Km）的測(cè)定

Km值的研究結(jié)果如圖8所示，在測(cè)定條件下，以過(guò)氧化氫（10～50mmol/L）為底物，測(cè)定該酶的活力，采用雙倒法作圖求得該酶的Km值為53.79mmol/L。

圖8 雙倒數(shù)法測(cè)定黃瓜POD的米氏常數(shù)Fig.8 Lineweaver-Burk plot for Kmdetermination of POD from cucumber

2.3.4 部分有機(jī)溶劑對(duì)黃瓜POD活性的影響

圖9 甲醇、乙醇、異丙醇對(duì)黃瓜POD活力的影響Fig.9 Effects of methanol, ethanol and isopropyl alcohol on the activity of POD from cucumber

如圖9所示，甲醇、乙醇、異丙醇均對(duì)該酶有抑制作用，隨著三者濃度不斷升高，酶活力逐漸受到抑制；異丙醇對(duì)該酶抑制作用相對(duì)較強(qiáng)，甲醇和乙醇對(duì)該酶抑制相對(duì)較弱，終濃度達(dá)50mmol/L時(shí)酶活力均保持在75%以上。

2.3.5 不同化合物對(duì)黃瓜POD活性的影響

圖10 不同化合物對(duì)黃瓜POD活力的影響Fig.10 Effects of various compounds on the activity of POD from cucumber

如圖10所示，在0～50 mmol/L范圍內(nèi)，隨著各自濃度的逐漸增加，KSCN對(duì)該酶活力基本無(wú)影響，濃度達(dá)到50 mmol/L時(shí)，酶活力均在90%以上；尿素對(duì)該酶有激活作用，且終濃度至50 mmol/L時(shí)使酶活力被激活至112%；草酸對(duì)該酶抑制作用較強(qiáng)；SDS和抗壞血酸對(duì)該酶抑制作用很強(qiáng)，當(dāng)其濃度達(dá)到10 mmol/L時(shí)，該酶的活力為0。

2.3.6 不同金屬離子對(duì)黃瓜POD活性的影響

圖11 不同金屬離子對(duì)黃瓜POD活力的影響Fig.11 Effects of metal ions on the activity of POD from cucumber

如圖11所示，不同金屬離子及同一金屬離子不同濃度對(duì)該酶活力的影響存在一定差異。Zn2+對(duì)該酶有一定抑制作用；K+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Cu2+對(duì)該酶有激活作用，且終濃度50mmol/L時(shí)該酶的活力分別被激活至127%、113%、128%、139%、199%、348%。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)以黃瓜為材料分離純化獲得電泳純的過(guò)氧化物酶，與其他報(bào)道相比較，具有以下特點(diǎn)：一是材料四季常見(jiàn)，成本低廉；二是過(guò)氧化物酶含有多種同工酶[14]。粗酶液經(jīng)CM-Sepharose離子交換層析后檢測(cè)到3種同工酶，為了獲得單一過(guò)氧化物酶純品，選取活力最高的峰作進(jìn)一步研究，經(jīng)Superdex-200凝膠過(guò)濾層析后仍然得到了較高的回收率（9.58%）、比活力（64177.67U/mg）、純化倍數(shù)（61.93），回收率高于棕櫚葉[15]（5.8%）、肖黃櫨[16]（3.3%)和甘薯葉[17]（1.59%）來(lái)源的POD，比活力和純化倍數(shù)高于來(lái)源于椰子[18]（12.8U/mg、9.77倍）和辣根[19]（26805U/mg、29.3倍）。

本實(shí)驗(yàn)所提純的黃瓜POD的作用溫度范圍較廣，在25～85 ℃均有酶活力且在30～70 ℃時(shí)該酶的活力均保持在80%以上，其最適溫度為60 ℃，與甘薯葉（60 ℃）[17]來(lái)源的相同，高于來(lái)源于棕櫚葉（55 ℃）[15]、乳（55 ℃）[20]、豆殼（30 ℃）[21]、女貞果實(shí)（40 ℃）[22]、蓮藕（35 ℃）[23]、香草豆（16 ℃)[24]的POD，高于辣根POD (30℃)和經(jīng)三聚氰酰氯絲固定化的辣根的POD（40 ℃）[25]，表明該酶的最適溫度較高。該酶在25～45 ℃范圍內(nèi)的熱穩(wěn)定性非常好，保溫5 h酶活力均保持在90%以上，55 ℃保溫5 h后酶活力保留49%且熱穩(wěn)定性高于經(jīng)三聚氰酰氯絲固定化的辣根POD[25]。該酶的最適pH值為6，和來(lái)源于辣根（pH 6）[25]和豆殼（pH 6）[21]的POD相同，低于女貞果實(shí)POD（pH 6.5）[22]、高于蓮藕POD（pH 5）[23]、乳POD（pH5～5.5）[20]，遠(yuǎn)高于香草豆POD（pH 3.8）[24]。pH值耐受范圍較廣，該酶在pH 5～9范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，保溫5 h其活力均保持在85%以上，在pH 3和pH 4保溫1 h酶活力還保留50%以上，其穩(wěn)定性高于棕櫚葉[15]和甘薯葉[17]來(lái)源的POD。在水果和蔬菜中POD的分子質(zhì)量一般介于30～54 kD[26]。該酶的亞基分子質(zhì)量為40.21 kD，與蓮藕（41.5 kD）[23]、紅薯（42.03 kD）[27]、苦瓜(43 kD)[28]來(lái)源的POD相近，低于椰子來(lái)源的POD同工酶（～47、9 kD）[18]、木瓜POD（69.4 kD）[29]，高于枇杷果肉POD（22.6 kD）[30]，可知該酶的分子結(jié)構(gòu)具有一定的物種差異性。該酶的Km值為53.79 mmol/L，高于豆殼POD（0.41 mmol/L）[21]，遠(yuǎn)低于紅甜菜POD（98.61 mmol/L）[31]和甘薯葉POD（291 mmol/L）[17]，可知該酶的親和力相對(duì)較高。

甲醇、乙醇、異丙醇對(duì)該酶均有抑制作用，與甘薯葉POD[17]所報(bào)道的結(jié)果一致。KSCN對(duì)該酶活力基本無(wú)影響，而對(duì)甘薯葉POD[17]有非常強(qiáng)烈的抑制作用。SDS、草酸、抗壞血酸對(duì)該酶都有顯著的抑制作用。SDS作為一種變性劑能破壞蛋白酶分子中的氫鍵和疏水作用，從而使該酶活力下降為零。草酸對(duì)該酶的抑制作用可能是由于維持該酶活性中心的構(gòu)象進(jìn)而使該酶的活力不斷下降直至失活?？箟难嶙鳛橐环N自由基清除劑能夠抑制氫過(guò)氧化物進(jìn)而抑制該酶的活性[32]。尿素對(duì)該酶有一定的激活作用。不同的金屬離子對(duì)POD酶活力的影響也不盡相同，隨著金屬離子濃度的增大，K+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Cu2+對(duì)該酶表現(xiàn)出激活的作用，濃度至50mmol/L時(shí)使該酶的活力分別激活至127%、113%、128%、139%、199%、348%，然而其中的Ca2+、Cu2+對(duì)辣根來(lái)源的POD[19]卻有一定的抑制作用。Zn2+對(duì)該酶有一定抑制作用，而對(duì)蓮藕POD[23]具有激活作用，說(shuō)明不同物種來(lái)源的POD在性質(zhì)上存在一定差異，可能是與所處環(huán)境相適應(yīng)的結(jié)果。

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Isolation, Purification and Characterization of Peroxidase from Cucumber

HU Rui-bin, LI Xing, WANG Hong-yang, WANG Jie, TANG Yun-ming*
(Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Chongqing Sweet-Potato Engineering Research Center, School of Life Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Electrophoresis-purity peroxidase was extracted from fresh cucumber and purified through homogenization, extraction, ammonium sulfate precipitation, CM-Sepharose and Superdex-200 chromatography. The specific activity, recovery and purification fold of the peroxidase were 64 177.67 U/mg, 9.58% and 61.93, respectively. Molecular mass of this purified enzyme was 40.21 kD as determined by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), while native gel filtration confirmed a monomer form of 41.15 kD. Besides, the peroxidase, whose optimum temperature and pH were 60 ℃ and 6, respectively, was comparatively stable in the temperature range of 25-45 ℃ and pH range of 5-9. The purified peroxidase showed Kmvalue of 53.79 mmol/L under definite conditions. In addition, its activity was scarcely affected by potassium thiocyanate (KSCN). The peroxidase was found to be activated by urea, K+, Mn2+, Ca2+, Mg2+, Ba2+and Cu2+by 12%, 27%, 13%, 28%, 39%, 99% and 248% at 50 mmol/L, respectively. However, the peroxidase activity was significantly inhibited by SDS, ascorbic acid and oxalic acid. Moreover, Zn2+, methanol, ethanol a nd isopropanol caused partial inhibitory effects on the peroxidase.

cucumber; peroxidase; isolati on and purification; characterization

Q946.5

A

1002-6630（2014）11-0168-06

10.7506/spkx1002-6630-201411034

2013-07-09

重慶市科委重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（CSTC2011AB1027）

胡瑞斌（1985 —），男，碩士研究生，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail：huruibin55@163.com

*通信作者：唐云明（1960 —），男，教授，博士，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail：tbright@swu.edu.cn