劉怡君，潘 沐，王明洋，王 惠，辛志宏

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

植物內(nèi)生菌為那些在生活史中的某一階段生活在植物組織內(nèi)、對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的菌[1]。大量研究表明[2-3]，植物內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性獨特的次級代謝產(chǎn)物，在生物制藥、環(huán)境生態(tài)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值，已經(jīng)成為尋找和發(fā)現(xiàn)各種生物活性物質(zhì)的重要資源。

在內(nèi)生真菌的研究過程中，菌株來源和有效的篩選方法是決定能否發(fā)現(xiàn)新型生物活性物質(zhì)的關(guān)鍵。常用的篩選方法是基于活性篩選和化學(xué)篩選或者二者的組合，這些方法在微生物次級代謝產(chǎn)物研究的過程中，曾經(jīng)發(fā)揮過巨大的作用，篩選到許多盛產(chǎn)活性物質(zhì)的菌株，但是隨著研究的深入，這些篩選方法固有的缺陷也逐漸顯現(xiàn)出來，最為突出的問題是在新化合物篩選的過程中，已知微生物和已知化合物不斷被重復(fù)發(fā)現(xiàn)，大大增加了新化合物的發(fā)現(xiàn)難度，造成了巨大浪費，這已經(jīng)成為植物內(nèi)生真菌研究過程中的最主要的制約因素。

近年來，隨著分子生物信息學(xué)的發(fā)展，部分微生物次級代謝產(chǎn)物合成酶系及其相關(guān)基因測序完成，生物合成機理越來越清晰，新的微生物篩選方法應(yīng)運而生。

基于聚酮合成酶（polyketide synthase，PKS）功能基因定向篩選，目標直接指向合成聚酮化合物的目標基因，成為發(fā)現(xiàn)新型天然活性物質(zhì)的重要策略之一，許多新發(fā)現(xiàn)的抑菌、抗腫瘤和抗病毒化合物都是由PKS合成的[4-6]。聚酮化合物的合成是以一個啟動單元和若干延展單元為原料，經(jīng)反復(fù)醇醛縮合和延伸而成，其過程與脂肪酸的合成類似。在合成途徑中它們均會產(chǎn)生含有多個酮基的中間代謝產(chǎn)物。催化合成這些中間產(chǎn)物的關(guān)鍵酶稱為聚酮合酶。PKS是生物合成次級代謝產(chǎn)物過程中的關(guān)鍵酶，對其合成基因深入研究不僅能夠大大提高發(fā)現(xiàn)新化合物的概率，而且可以預(yù)測產(chǎn)生化合物的類型[7-8]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的聚酮合酶按結(jié)構(gòu)和催化機制大致可分為Ⅰ型（又稱模件型）、Ⅱ型（又稱重復(fù)型）及Ⅲ型（又稱查爾酮型）三大類[9]。真菌來源的PKS常屬Ⅰ型，細菌PKS常屬于Ⅰ和Ⅱ型，植物PKS屬于Ⅲ型。PKS編碼基因具有同源性和許多保守區(qū)域，為基因篩選提供了分子基礎(chǔ)。PKS由載體蛋白（acylcarrier protein，CP）、?；D(zhuǎn)移酶（acyltransferase，AT）、酮合成酶（ketosynthase，KS）、酮還原酶、脫水酶、烯脂酰還原酶等模塊組成，以β-酮酸為單體按順序依次添加到碳骨架上。PKS基因是模塊化的，眾多模塊連在一起組成多功能酶或多酶體系，模塊類型、數(shù)量和排列順序決定了產(chǎn)物的多樣化和功能的多樣化[10-11]。基因組的常用研究方法包括免疫篩選法、遺傳互補法、異源探針法和同源探針法等[12-13]，其中最常用的是基于簡并引物PCR擴增的同源探針法，擴增結(jié)果往往對應(yīng)菌株產(chǎn)生的化合物類型。Bingle等[14]根據(jù)真菌PKS中最為保守的功能區(qū)域——KS單元的保守序列設(shè)計出兩對簡并引物（LC1/LC2c和LC3和LC5c），從不同真菌中擴增得到了苯并吡喃酮聚酮合酶（WA）型和甲基水楊酸合成酶（MSAS）型的PKS片段。WA型涉及色素和黃曲霉毒素的生物合成，MSAS型則主要參與6-甲基水楊酸的生物合成。Nicholson等[15]根據(jù)真菌PKS催化聚酮化合物合成過程中還原程度不同將其分為3類：非還原型或芬芳（non-reduced，NR）PKS，即催化過程中無還原步驟的真菌PKS；部分還原型（partially reduced，PR）PKS，即只有一個或幾個還原步驟的真菌PKS；高度還原型（highly reduced，HR）PKS，即有多個還原步驟的真菌PKS。根據(jù)此分類方法，上述WA和MSAS型的PKS可分別歸入NR、PR和HR 3種類型。其中WA型屬于非還原型 PKS，MSAS型大多數(shù)屬于部分還原型PKS，而有一部分MSAS型PKS則屬于高度還原型PKS。還原型PKS通常以硫酯化羧酸輔酶A為起始單元，催化合成線性聚酮化合物，如洛伐他汀、煙曲霉毒素等，而非還原型PKS一般以乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A為起始單元，合成環(huán)狀化合物，如黃曲霉毒素、桔霉素等。

目前，通過跟蹤PKS基因篩選目標菌株，大多集中在細菌與宿主的關(guān)系及其生態(tài)作用的報道，有關(guān)真菌PKS基因篩選罕見報道。

本實驗以采自新疆鹽湖的野生海蘆筍（Salicornia bigelovii）為研究對象，采用平板劃線分離、斜面分離純化技術(shù)分離海蘆筍內(nèi)生真菌，以PKSⅠ型功能基因為指標，篩選出具有PKSⅠ型基因的真菌，在此基礎(chǔ)上，提取內(nèi)生菌DNA，PCR擴增18S rDNA和rDNA ITS目標序列，在NCBI上進行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，確定其種屬地位，以期篩選到具有PKSⅠ型功能基因的內(nèi)生真菌，提高新化合物的發(fā)現(xiàn)機率。

1 材料與方法

1.1 試劑與培養(yǎng)基

野生鹽生海蘆筍采自新疆鹽湖。

D3390-01 E.Z.N.A真菌DNA微量提取試劑盒 美國Omega公司；DR001AM PCR試劑、Ver.3.0 D823A瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒、D102A pMD19-T載體 日本TaKaRa公司。

PDA固體培養(yǎng)基（g/L）：土豆200、葡萄糖20、瓊脂20、NaCl 30、海水素10、海蘆筍提取液250，自來水配制。

真菌發(fā)酵液體培養(yǎng)基（g/L）：土豆200、麥芽糖20、甘露醇20、葡萄糖10、味精5、蛋白胨5、酵母膏3，pH 6.0。

LB液體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10，pH 7.2。

1.2 儀器與設(shè)備

ECLIPSE TE2000-S 熒光倒置顯微鏡 日本Nikon株式會社；Microfuge 22R臺式微量冷凍離心機 美國Beckman公司；TP600型梯度PCR儀 日本TaKaRa公司；DYCP-31DN電泳儀 北京市六一儀器廠；JS-380C全自動數(shù)碼凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司。

1.3 內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)

菌株Salix 1是從新疆鹽湖野生海蘆筍中分離得到，菌株分離采用PDA固體培養(yǎng)基，在無菌操作下，取1 根野生海蘆筍，依次經(jīng)過75%乙醇、1%次氯酸鈉、75%乙醇分別浸泡1 min，然后用無菌水漂洗3 次，無菌吸水紙干燥。用滅菌后的剪刀將其剪成7～9 mm小段，放在PDA平板上，每板3～5 根，于28 ℃恒溫培養(yǎng)至植物組織內(nèi)部長出菌絲。將真菌轉(zhuǎn)移到新的平板培養(yǎng)基上劃線分離得到單個菌落，然后轉(zhuǎn)移到PDA斜面試管中，4 ℃保存。

1.4 內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)觀察

從保藏菌種的斜面培養(yǎng)基中挑取菌絲轉(zhuǎn)接到PDA平板培養(yǎng)基中間位置，28 ℃培養(yǎng)3～4 d，觀察菌落大小、顏色、質(zhì)地等形態(tài)特征，記錄生長速率。

1.5 基因組DNA的提取

從保藏菌種的斜面培養(yǎng)基中挑取菌絲轉(zhuǎn)接到PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)4～5 d。基因組DNA的提取采用真菌DNA微量提取試劑盒進行。稱取40 mg新鮮樣品至2 mL離心管，加600 μL FG1，玻璃棒研磨4 min；加5 μL 20 mg/mL RNA酶，65 ℃水浴20 min；加140 μL FG2、13 000×g離心10 min；吸600 μL上清液，加300 μL FG3和600 μL無水乙醇；將全部溶液移至HiBind DNA管，10 000×g離心1 min，棄廢液。換一新2 mL收集管，加700 μL DNA Wash Buffer（已加乙醇），10 000×g離心1 min，棄廢液。將HiBind DNA管放入1.5 mL離心管，加50 μL Elution Buffer，室溫放置5 min，10 000×g離心1 min，收集DNA濾液。提取的基因組DNA在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測（120 V、30 min），溴化乙錠染色。4 ℃保存?zhèn)溆?，或?20 ℃長期保存。

1.6 PKS基因片段的PCR 擴增

PKS區(qū)域的擴增選擇真核生物PKS通用的3對引物：KAF1/KAR1、KAF1/KAR2、LC1/LC2C。 KAF1 （5’-GAR KSI CAY GGI ACI GGI AC-3’）；KAR1 （5’-CCA YTG IGC ICC RTG ICC IGA RAA-3’）；KAR2 （5’-CCA YTG IGC ICC YTG ICC IGT RAA-3’）；LC1 （5’-GAY CCI MGI TTY TTY AAY ATG-3’）；LC2C （5’-GTI CCI GTI CCR TGC ATY TC-3’）。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃、4 min；變性95 ℃、30 s，退火50 ℃、1 min，延伸72 ℃、2 min，共35 個循環(huán)；最后延伸72 ℃、10 min[14-15]。

1.7 18S rDNA基因片段的PCR擴增

18S rDNA區(qū)域的擴增選擇真核生物18S rDNA的通用擴增引物：NS1（5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’），NS8（5’-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3’）。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.75 min，共35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min[16]。

1.8 rDNA ITS基因片段的PCR擴增

ITS區(qū)域的擴增選擇真核生物ITS通用擴增引物：ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’），ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性94 ℃、2 min；變性94 ℃、30 s，退火59 ℃、30 s，延伸72 ℃、90 s，共35 個循環(huán)；最后延伸72 ℃、7 min[16]。

1.9 PCR產(chǎn)物的回收和克隆

采用瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒回收PCR產(chǎn)物，純化的PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化至EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞中。在-70 ℃保存的100 μL感受態(tài)細胞E.coliDH5α中加入10 μL連接產(chǎn)物，冰中放置30 min，取出后42 ℃熱激90 s，加入890 μL LB液體培養(yǎng)基37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h。菌液涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板，倒置過夜培養(yǎng)，挑取白色單菌落培養(yǎng)。取0.5 μL菌液直接做PCR，引物為M13RV（5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’）和M13-47（5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’），電泳檢測是否含有目的片段。PCR采用25 μL的反應(yīng)體系，包括ddH2O 13.75 μL、10×PCR Buffer（Mg2+）5 μL、25 mmol/L MgCl22.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、20 μmol/L Primer-F 0.5 μL、20 μmol/L Primer-R 0.5 μL、DNA 0.5 μL、5 U/μLTaq聚合酶0.25 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

分離菌株Salix 1在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)4 d后，菌落呈絲絨狀，直徑為15～17 mm，培養(yǎng)初期菌落正面呈白色后轉(zhuǎn)綠色直至暗褐色，氣生菌絲體呈淺褐粉紅色，有輻射狀溝紋，菌落反面自近于無色至淡黃褐色，色素擴散于生長基質(zhì)。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

2.2.1 菌株Salix 1 PKS系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建與分析

圖1 基于PKS基因LC系列引物序列構(gòu)建的鄰接樹Fig.1 Neighbor-joining tree based on LC series of primers for PKS gene sequences

分別選用KAF1/KAR1、KAF1/KAR2、LC1/LC2C3對簡并引物對其PKS基因序列進行擴增。提取真菌Salix 1 DNA后進行PCR擴增，僅有LC1/LC2C引物擴增得到732 bp的目的條帶并測序，該序列在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫將核酸序列轉(zhuǎn)化為蛋白序列并BLAST搜索，從中下載同源性最高的蛋白序列，采用MEGA5.0軟件，將Salix 1對應(yīng)的蛋白序列與37株下載的蛋白序列進行比對，以鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建PKS進化樹，如圖1所示。能夠產(chǎn)生相同化學(xué)類型化合物的真菌分別聚為一枝，說明同種真菌的不同菌株或不同真菌能夠產(chǎn)生相同類型的化合物，如不同的煙曲霉菌株能夠產(chǎn)生黑色素，而黃曲霉和米曲霉都能產(chǎn)生黃曲霉毒素。Salix 1蛋白序列單獨聚為一枝，但與WA型PKS比較接近，提示該菌株可能產(chǎn)生具有苯并吡喃酮聚酮的新化合物[14-15]。

2.2.2 菌株Salix 1 18S rDNA和ITS系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建與分析

圖2 基于18S rDNA基因序列構(gòu)建的鄰接樹Fig.2 Neighbor-joining tree based on 18S rDNA gene sequences

菌株Salix 1經(jīng)PCR擴增獲得的18S rDNA序列全長為1 705 bp，在NCBI中進行BLAST比對，該菌株18S rDNA序列與Aspergillussp.同源性最高，相似度達99%。根據(jù)18S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，由圖2可以看出，基本上不同的種形成不同的獨立分枝，相同種聚為一枝，菌株Salix 1與Aspergillus versicolorHDJZ-ZWM-16（GU227343）和Aspergillus versicolor（AB008411）聚為一枝，自展值為91，表現(xiàn)出非常近的親緣關(guān)系。獲得的菌株ITS序列全長為573 bp，在NCBI中進行BLAST比對，該菌株ITS序列與Aspergillus versicolor的ITS序列同源性最高，相似度達99%。根據(jù)ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹圖3可以看出，基本上不同的種形成不同的獨立分枝，相同種聚為一枝，菌株Salix 1與Aspergillus versicolorSGE24（JX232271）和Aspergillus versicolorRF6（GU232767）聚為一枝，自展值為89，表現(xiàn)出非常近的親緣關(guān)系。綜上所述，鑒定菌株Salix 1為子囊菌綱Ascomycetes、散囊菌目Eurotiales、發(fā)菌科Trichocomaceae、曲菌屬Aspergillus、雜色曲霉Aspergillus versicolor。

圖3 基于rDNA ITS基因序列構(gòu)建的鄰接樹Fig.3 Neighbor-joining tree based on ITS gene sequences

3 討 論

微生物基因組中是否含有編碼次級代謝產(chǎn)物合成的基因簇是產(chǎn)生相應(yīng)活性產(chǎn)物的分子基礎(chǔ)，分子生物學(xué)的快速發(fā)展使合成微生物次級代謝產(chǎn)物的合成酶系、相關(guān)基因序列及生物合成途徑的逐步闡明，奠定了從基因到新化合物預(yù)測的理論基礎(chǔ)，成為現(xiàn)代天然產(chǎn)物研究與開發(fā)的有效手段?；赑KSⅠ型基因分析方法在產(chǎn)生聚酮化合物真菌菌株的篩選過程中，目標直接指向新化合物，大大降低了傳統(tǒng)活性追蹤方法研究過程中的重復(fù)性，提高了工作效率。

本實驗以PKSⅠ型功能基因為導(dǎo)向，從采自新疆鹽湖的野生海蘆筍中分離到1株編號為Salix 1的內(nèi)生真菌含有PKSⅠ型基因，PCR擴增該菌的18S rDNA和ITS1-5.8SITS2 rDNA目標序列，經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，將菌株Salix 1鑒定為雜色曲霉。已有研究證實，雜色曲霉能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的活性次級代謝產(chǎn)物。Lin wenhan等[17-18]先后從海綿Xestospongia exigua中分離得到雜色曲霉，對其進行發(fā)酵培養(yǎng)，從發(fā)酵產(chǎn)物中得到13個新的次級代謝產(chǎn)物，利用二維核磁共振、質(zhì)譜、紫外光譜等手段鑒定了這些化合物都為具有苯并吡喃酮結(jié)構(gòu)的色原酮類化合物，這些化合物具有相似的化學(xué)骨架，只是取代基存在差異，這說明微生物產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物大都是結(jié)構(gòu)上相近的系列衍生產(chǎn)物，這可能是因為對于同一種菌株的次級代謝產(chǎn)物具有基本相同的生物合成途徑的緣故。另外，不同種屬的真菌也能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似或相同的化合物，這對于篩選有價值的活性化合物高產(chǎn)菌株具有重要的實際應(yīng)用價值。

迄今為止，還未見有關(guān)鹽生海蘆筍中分離出雜色曲霉的報道。盡管對雜色曲霉的次級代謝產(chǎn)物已有報道，但是微生物基因組中常常存在暫時喪失表達活性而靜默的沉默基因，使得一些有價值的化合物在常規(guī)實驗條件下產(chǎn)量很低或無法產(chǎn)生[19-20]，如何通過環(huán)境刺激、培養(yǎng)條件優(yōu)化、異源表達以及遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)手段對隱藏的次級代謝途徑進行活化、上調(diào)和操縱，對于新型化合物的深入挖掘具有重要意義。今后將采用多種培養(yǎng)方式對該菌的發(fā)酵條件進一步優(yōu)化，系統(tǒng)全面研究該菌的次級代謝產(chǎn)物與生物活性，為豐富和完善真菌功能基因的基礎(chǔ)理論提供依據(jù)。

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