魏寶東，王利艷，于思雯，潘婭慧

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

植物激素對(duì)納塔爾鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)納他霉素的影響

魏寶東，王利艷，于思雯，潘婭慧

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

以納塔爾鏈霉菌（Streptomyces natalensis）為發(fā) 酵菌種，在搖瓶培養(yǎng)基中添加植物激素，通過(guò)單因素試驗(yàn)初篩，獲得能夠有效提高納他霉素的產(chǎn)量的植 物激素；采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)建立數(shù)學(xué)模型，進(jìn)行響應(yīng)面分析優(yōu)化確定最優(yōu)組合。結(jié)果表明：吲哚乙酸、赤霉素和6-芐氨基嘌呤均能夠有效提高納他霉素的產(chǎn)量，在5.5 mg/L吲哚乙酸、14.8 mg/L赤霉素和20.5 mg/L 6-芐氨基嘌呤的條件下發(fā)酵120 h時(shí)，發(fā)酵液中納他霉素的發(fā)酵產(chǎn)量可達(dá)到1.805 g/L，為對(duì)照組的1.63 倍。

植物激素；納塔爾鏈霉菌；納他霉素；發(fā)酵；響應(yīng)面分析

納他霉素為一種多烯烴大環(huán)內(nèi)酯類抗真菌劑，別名游鏈霉素、匹馬菌素或海松素[1]，是一種高效、廣譜的抗真菌類抗生素[2]，主要由褐黃孢鏈霉菌（Streptomyces gilvosporeus）、納塔爾鏈霉菌（Streptomyces natalensis）、恰努加鏈霉菌（Streptomvces chattanoogensis）等發(fā)酵產(chǎn)生[3]。由于它只抑制真菌且效率高、使用pH值范圍寬、毒性低、無(wú)特殊顏色和氣味且對(duì)產(chǎn)品的感官特性無(wú)任何影響等優(yōu)點(diǎn)[4]，從而被廣泛地應(yīng)用于食品工業(yè)、動(dòng)物飼料、治療真菌引起的疾病等方面[5]。但由于納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量水平較低，成本太高，目前國(guó)內(nèi)還無(wú)法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，納他霉素產(chǎn)品主要依靠進(jìn)口，限制了其作為新型的天然生物防腐劑的廣泛應(yīng)用[6]。因此，研究納他霉素微生物發(fā)酵的規(guī)律，從而指 導(dǎo)和改進(jìn)其發(fā)酵工藝，對(duì)提高納他霉素的發(fā)酵水平具有重要意義[7]。目前，對(duì)于提高納他霉素的產(chǎn)量的研究仍側(cè)重于菌種選育及培養(yǎng)條件的優(yōu)化方面[8-11]，微生物發(fā)酵相關(guān)的報(bào)道較少。

植物激素在代謝、生長(zhǎng)、形態(tài)建成等植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)方面均起著十分重要的作用，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有著廣泛的應(yīng)用。但是，利用植物激素促進(jìn)微生物次級(jí)代謝提高次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的研究鮮有報(bào)道。僅有將植物激素應(yīng)用于藻類微生物、甾體微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)、香菇的研究，結(jié)果表明植物激素能夠有效地調(diào)節(jié)海藻類微生物、甾體轉(zhuǎn)化微生物、香菇的生長(zhǎng)發(fā)育以及某些代謝產(chǎn)物的合成[12-16]。但其對(duì)納他霉素的產(chǎn)量的影響未見(jiàn)報(bào)道，因此，本實(shí)驗(yàn)采用植物激素對(duì)微生物發(fā)酵生產(chǎn)納他霉素的影響進(jìn)行初步研究，為植物激素對(duì)微生物次級(jí)代謝調(diào)控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

納塔爾鏈霉菌（Streptomyces natalensis） 日本微生物菌種保藏中心。

麥芽浸粉、大豆蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；酵母浸粉、葡萄糖、可溶性淀粉、甲醇（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；納他霉素標(biāo)準(zhǔn)品 北京東方瑞德生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-F全溫振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱東明醫(yī)療儀器廠；超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司設(shè)備廠；手動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱 南京中器三廠；UV-1600紫外分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司；PHS-25數(shù)顯pH計(jì) 上海雷磁儀器廠。

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（g/L）：麥芽浸粉10、酵母浸粉4、葡萄糖4、瓊脂20，pH7.3；種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20、大豆蛋白胨6、酵母浸粉6、氯化鈉10，pH7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：麥芽浸粉10、大豆蛋白胨10、可溶性淀粉10、酵母浸粉4、葡萄糖（50g/100mL的葡萄糖進(jìn)行單獨(dú)滅菌）40，pH7.3。

1.4 方法

1.4.1 提高納他霉素產(chǎn)量的植物激素單因素試驗(yàn)

各種植物激素均加在納他霉素發(fā)酵培養(yǎng)基中[12]，將納塔爾鏈霉菌接種于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7 d，用適量無(wú)菌水洗下新鮮孢子制備成108CFU/mL孢子懸浮液[5]，然后取5mL孢子懸液接種到裝液量為20%的250 mL三角瓶中，在29 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)28～48 h，使菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)和穩(wěn)定期，以2%接入量接種 到發(fā)酵培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)120 h，以發(fā)酵液中納他霉素的產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行有正向調(diào)節(jié)作用的植物激素的篩選。

由于已知的植物激素主要有以下5類：生長(zhǎng)素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫落酸和乙烯。根據(jù)文獻(xiàn)資料本實(shí)驗(yàn)選擇生長(zhǎng)素、赤霉素、細(xì)胞分裂素3類植物激素作為材料，它們分別是生長(zhǎng)素中的吲哚乙酸（indoleacetic acid，IAA）、吲哚丁酸（indole butyric acid，IBA）、1-萘乙酸（1-naphthyl acetic acid，NAA）、赤霉素（3-gibberellic acid，GA3）和細(xì)胞分裂素中的6-芐氨基嘌呤（6-benzyl aminopurine，6-BA），分別配制成質(zhì)量濃度為500mg/L的溶液備用。

以發(fā)酵液中納他霉素的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在納塔爾鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)的基礎(chǔ)上進(jìn)行植物激素添加量的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)：在納塔爾鏈霉菌發(fā)酵液中分別添加IAA、IBA、NAA、GA3和6-BA，質(zhì)量濃度分別為0、5、10、15、20、25mg/L。通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選獲得對(duì)納他霉素產(chǎn)量有正向調(diào)節(jié)作用的植物激素。

按單因素試驗(yàn)選出的各植物激素最佳質(zhì)量濃度添加到培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵時(shí)間的確定。發(fā)酵時(shí)間分別為12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132h時(shí)，取樣測(cè)定納他霉素產(chǎn)量，以發(fā)酵液中納他霉素的產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行發(fā)酵時(shí)間的確定。

1.4.2 提高納他霉素產(chǎn)量的植物激素響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)納他霉素的微生物發(fā)酵產(chǎn)量影響較大的植物激素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，以發(fā)酵液中納他霉素的發(fā)酵產(chǎn)量為響應(yīng)指標(biāo)，利用Design-Expert8.0軟件進(jìn)行回歸分析，預(yù)測(cè)植物激素在納塔爾鏈霉菌發(fā)酵體系中的最佳組合。

1.4.3 納他霉素的測(cè)定

取1 mL納他霉素發(fā)酵液添加到裝有9 mL甲醇提取劑的離心管中，充分振蕩后于12 000 r/min離心15 min，吸取上清液用甲醇進(jìn)行適當(dāng)稀釋，在303 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。根據(jù)吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析[17]。

1.4.4 還原糖的檢測(cè)

采用DNS比色法[18]。

1.4.5 菌體干質(zhì)量的測(cè)定

菌體干質(zhì)量（dry cell weight，DCW）的測(cè)定參考文獻(xiàn)[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 納他霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

采用紫外分光光度計(jì)法，以發(fā)酵液中納他霉素產(chǎn)量為橫坐標(biāo)（x），其對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定發(fā)酵液中納他霉素的產(chǎn)量。應(yīng)用最小二乘法原理獲得線性回歸方程為y=0.1071x－0.0061，由相關(guān)系數(shù)R2=0.9998可知本測(cè)定方法在1～9mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好[20]。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同質(zhì)量濃度的植物激素對(duì)納他霉素產(chǎn)量的影響

本實(shí)驗(yàn)將選擇的5種植物激素：吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、1-萘乙酸（NAA）、赤霉素（GA3）、6-芐氨基嘌呤（6-BA），分別以不同質(zhì)量濃度添加到發(fā)酵液中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探索它們?cè)谝后w培養(yǎng)條件下對(duì)納塔爾鏈霉菌合成納他霉素的影響，進(jìn)而篩選出對(duì)發(fā)酵液中納他霉素的產(chǎn)量有促進(jìn)作用的植物激素。

圖1 不同質(zhì)量濃度的植物激素對(duì)納他霉素產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of different concentrations of plant hormones on natamycin production

從圖1可以看出，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，發(fā)酵液中納他霉素的產(chǎn)量隨著植物激素質(zhì)量濃度的增加而增大，IAA 5mg/L時(shí)產(chǎn)量相對(duì)較高；IBA 15mg/L時(shí)產(chǎn)量相對(duì)較高；NAA 20mg/L時(shí)產(chǎn)量相對(duì)較高；GA3 15mg/L時(shí)產(chǎn)量相對(duì)較高；6-BA 20mg/L時(shí)產(chǎn)量相對(duì)較高。植物激素質(zhì)量濃度繼續(xù)增大時(shí)，反而影響了納他霉素的合成，表明此體系中植物激素存在最適質(zhì)量濃度。

5種植物激素均能有效提高發(fā)酵液中納他霉素的產(chǎn)量，原因可能是植物激素能夠有效的促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂，導(dǎo)致菌體數(shù)量增加，進(jìn)而提高納他霉素的產(chǎn)量；也可能在微生物生長(zhǎng)過(guò)程中加入適量的植物激素，促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝，加速其分裂與增殖，促進(jìn)菌體旺盛生長(zhǎng)和產(chǎn)酶[21]。進(jìn)而促進(jìn)次級(jí)代謝，使納他霉素的產(chǎn)量提高。由此本實(shí)驗(yàn)對(duì)菌體干質(zhì)量和總糖含量變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示變化不明顯，具體原因需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

本實(shí)驗(yàn)中植物激素篩選的條件雖參照張桂和等[12]的報(bào)道，但所得篩選結(jié)果卻與其有所不同。張桂和等[12]利用2,4-二氯苯氧乙酸、6-芐基氨基嘌呤、奈乙酸、激動(dòng)素、吲哚乙酸、吲哚丁酸，當(dāng)質(zhì)量濃度范圍在0.01～2.0mg/L時(shí)，植物激素對(duì)小球藻和異膠藻的生長(zhǎng)均有明顯的促進(jìn)作用，它們能促進(jìn)藻細(xì)胞的分裂，增加藻色素的含量。

生長(zhǎng)素中的吲哚乙酸（IAA）能夠顯著提高發(fā)酵液中納他霉素的產(chǎn)量，添加吲哚乙酸后的發(fā)酵液中納他霉素的產(chǎn)量為對(duì)照組不添加激素的152.1%，因此將其與赤霉素和6-芐氨基嘌呤作為后續(xù)響應(yīng)面分析的因素。

2.2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)納他霉素產(chǎn)量的影響

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)納他霉素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of fermentation time on natamycin production

由圖2可知，發(fā)酵時(shí)間在72 h之前，納他霉素的產(chǎn)量均緩慢增加；72～96 h納他霉素的產(chǎn)量迅速增加；之后增加速度逐漸趨于平緩，發(fā)酵至120 h各自達(dá)到最高點(diǎn)；到132 h時(shí)只有對(duì)照中納他霉素的產(chǎn)量下降，其他均無(wú)變化。因此，將最適質(zhì)量濃度的植物激素添加到發(fā)酵液中，發(fā)酵時(shí)間為120 h時(shí)納他霉素的產(chǎn)量達(dá)到最大，120 h以后納他霉素的產(chǎn)量不再繼續(xù)增加。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理[22]，選擇IAA（A）、GA3（B）、6-BA（C）作為響應(yīng)面優(yōu)化的考察因素，每個(gè)因素取3種水平，以（－1、0、1）編碼，以發(fā)酵液中納他霉素的發(fā)酵產(chǎn)量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)。

應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，依次進(jìn)行添加IAA、GA3、6-BA（每組3個(gè)平行）[23]，以發(fā)酵液中納他霉素產(chǎn)量為響應(yīng)值（Y）進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table1 Box-Behnken design and results

2.3.2 回歸模型的建立及統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)表1的結(jié)果，通過(guò)Design-Expert8.0軟件處理確定回歸方程，該試驗(yàn)的回歸方程為：Y=1.81＋0.019A＋0.037B＋8.25C＋0.019AB＋5.51AC＋0.047BC－0.022A2－0.098B2－0.11C2?；貧w模型進(jìn)行方差分析及可信度分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回歸方程的統(tǒng)計(jì)分析Table2 Statistical analysis of the fitted regression equation

B、BC、B2和C2的二次項(xiàng)對(duì)發(fā)酵液中納他霉素的發(fā)酵產(chǎn)量影響均具顯著性（P＜0.01），其他變量影響均不顯著（P＞0.05），無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。簡(jiǎn)化后的回歸方程為：Y=1.80900－0.018500A＋0.037250B＋0.0825000C＋0.018500AB－5.50000AC－0.047000BC＋0.022500A2－0.098500B2－0.11100C2。模型極顯著（P＜0.01），因變量與自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2=0.9698），模型調(diào)整復(fù)相關(guān)系數(shù)=0.9311，說(shuō)明該模型能解釋93.11%響應(yīng)值的變化，擬合程度較好。失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所得二次回歸方程能很好地對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測(cè)。

圖3 各因素及其相互作用對(duì)納他霉素產(chǎn)量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots showing the effects of different concentrations of IAA, GA3 and 6-BA on natamycin production

由圖3可知，在固定其他發(fā)酵參數(shù)條件下，IAA的質(zhì)量濃度設(shè)定于某值時(shí)，隨著GA3質(zhì)量濃度逐漸增大，納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量出現(xiàn)先增加后減少的現(xiàn)象，且兩因素交互作用出現(xiàn)最高點(diǎn)即穩(wěn)定點(diǎn)，說(shuō)明此過(guò)程中發(fā)酵體系存在最適質(zhì)量濃度，結(jié)合等高線圖形說(shuō)明兩自變量間交互作用顯著。在固定其他發(fā)酵參數(shù)條件下，IAA的質(zhì)量濃度設(shè)定于某值時(shí)，隨著6-BA質(zhì)量濃度逐漸增大，納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量出現(xiàn)先增加后減少的現(xiàn)象，且兩因素交互作用出現(xiàn)最高點(diǎn)即穩(wěn)定點(diǎn)，說(shuō)明此過(guò)程中發(fā)酵體系存在最適質(zhì)量濃度，結(jié)合等高線圖形說(shuō)明兩自變量間交互作用顯著。等高線圖形近似橢圓形，說(shuō)明兩自變量間交互效應(yīng)明顯，在固定其他發(fā)酵參數(shù)條件下，GA3的質(zhì)量濃度設(shè)定于某值時(shí)，隨著6-BA質(zhì)量濃度逐漸增大，納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量出現(xiàn)先增加后減少的現(xiàn)象，且兩因素交互作用出現(xiàn)最高點(diǎn)即穩(wěn)定點(diǎn)，說(shuō)明此過(guò)程中發(fā)酵體系存在最適質(zhì)量濃度。

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)各試驗(yàn)因子A、B、C所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，從響應(yīng)面分析圖上可形象地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用。根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面分析圖及相應(yīng)的等高線圖，運(yùn)用Design Expert8.0軟件對(duì)模型進(jìn)行分析。由圖3可較直觀的看出各因素交互作用對(duì)納他霉素的產(chǎn)量的影響，相應(yīng)的值為0.411、－0.189、0.372時(shí)，響應(yīng)達(dá)到最高點(diǎn)[24]，此時(shí)IAA、GA3、6-BA質(zhì)量濃度分別為5.411、14.811、20.372mg/L?？紤]實(shí)際操作性，將各誘導(dǎo)工藝參數(shù)修正為：IAA、GA3、6-BA質(zhì)量濃度分別為5.5、14.8、20.5mg/L，此時(shí)發(fā)酵液中納他霉素的發(fā)酵產(chǎn)量最高，預(yù)測(cè)值為1.812g/L。為了檢驗(yàn)回歸模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，在所得最佳誘導(dǎo)條件下進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)酵液中納他霉素的實(shí)際產(chǎn)量分別為1.805g/L，與預(yù)測(cè)值十分接近，可見(jiàn)該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際誘導(dǎo)情況。

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)5種不同植物激素進(jìn)行篩選，得知IAA、GA3和6-BA能夠有效促進(jìn)納塔爾鏈霉菌合成納他霉素。通過(guò)單因素試驗(yàn)和Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化這3種激素的最佳組合，得出優(yōu)化配比為：IAA的質(zhì)量濃度為5.5mg/L、GA3的質(zhì)量濃度為14.8mg/L、6-BA的質(zhì)量濃度為20.5mg/L，此條件下發(fā)酵液中納他霉素的發(fā)酵產(chǎn)量可達(dá)到1.805g/L，比對(duì)照（1.105g/L）高出63.3%。

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Influences of Plant Hormones on the Natamycin Production of Streptomyces natalensis

WEI Bao-dong, WANG Li-yan, YU Si-wen, PAN Ya-hui
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Screening of five plant hormones was carried out to find out those that can effectively enhance natamycin production in shake-flask culture by Streptomyces natalensis upon addition to the medium. A mathematical model was built using Box-Behnken experimental model and used to determine the optimal concentrations of selected plant hormones in the medium. The results showed that indole-3-acetic acid, gibberellin and 6-benzyl amino purine effectively increased natamycin production. At optimized concentrations of 5.5, 14.8 and 20.5 mg/L for these plant hormones, respectively, the yield of natamycin was 1.805 g/L, which was 1.63 times higher than that of the control group.

plant hormones; Streptomyces natalensis natamycin; fermentation; response surface methodology

TS201.3

A

1002-6630（2014）11-0185-05

10.7506/spkx1002-6630-201411037

2013-11-01

遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目（L2012248）

魏寶東（1969—），男，副教授，博士，主要從事食品制造與貯藏研究。E-mail：bdweisyau@163.com