■陳姣姣 來航線 馬軍妮 薛泉宏

(西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，陜西楊凌712100)

隨著我國畜牧業(yè)和飼料工業(yè)的發(fā)展，飼料原料匱乏及成本不斷增加已成為制約養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素。我國是蘋果生產(chǎn)大國，每年因蘋果汁加工產(chǎn)生蘋果渣300多萬噸。利用蘋果渣作飼料可以有效解決飼料原料不足，但蘋果渣中蛋白質(zhì)、脂肪含量低，蘋果酸、單寧、果膠及其他碳水化合物含量高，直接飼喂易引起胃內(nèi)酸度過大，造成腸道微生態(tài)平衡失調(diào)，影響攝食量和消化利用率[1]。通過發(fā)酵提高發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量可以改善發(fā)酵飼料的營養(yǎng)品質(zhì)。近年國內(nèi)研究者對蘋果渣發(fā)酵工藝進行了較多研究，但重點集中在發(fā)酵對飼料蛋白質(zhì)含量的影響[2-3]，對發(fā)酵引起的氨基酸含量及種類變化關(guān)注不多，影響了對蘋果渣發(fā)酵飼料的營養(yǎng)評價。本文重點研究發(fā)酵劑及玉米漿對蘋果渣發(fā)酵產(chǎn)物氨基酸種類及含量的影響，旨在為蘋果渣發(fā)酵飼料營養(yǎng)品質(zhì)評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種及復(fù)合發(fā)酵劑

黑曲霉 UA8（Aspergillas niger）、白地霉 B1410（Geotrichum candidum）及酵母菌（Yeast）均由西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院微生物資源研究室提供。

發(fā)酵劑：2種復(fù)合發(fā)酵劑分別為白地霉+黑曲霉（Geotrichum candidum+Aspergillus niger，縮寫為GcAn）及酵母菌+黑曲霉(Yeast+Aspergillus niger，縮寫為YAn)組合。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌種活化培養(yǎng)基：黑曲霉UA8活化及孢子懸液制備為PDA固體培養(yǎng)基及麩皮培養(yǎng)基；白地霉B1410、酵母菌活化及液體菌種制備用PDA固體培養(yǎng)基及PDA液體培養(yǎng)基，參考程麗娟等方法[4]。

蘋果渣固態(tài)發(fā)酵原料：烘干蘋果渣由眉縣恒興果汁有限公司提供。玉米漿由商惠酒精有限公司提供。尿素從市場購買。原料A按蘋果渣∶尿素=19∶1的質(zhì)量比配制；原料B按蘋果渣∶玉米漿干粉∶尿素=17∶2∶1的質(zhì)量比配制。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備

黑曲霉UA8孢子懸液制備采用賀克勇法[5]，白地霉B1410及酵母菌懸液制備采用任雅萍法[6]。血球計數(shù)法測得UA8孢子懸液、B1410及酵母菌懸液濃度分別4.32×108、4.09×108和4.50×108cfu/ml。將上述UA8孢子懸液與B1410細胞懸液及UA8孢子懸液與酵母菌懸液分別按1∶1體積比混合，組成兩種復(fù)合發(fā)酵劑菌懸液。

1.2.2 方案

試驗共設(shè)4個處理：原料A+GcAn，原料B+GcAn，原料A+YAn，原料B+YAn，每處理重復(fù)3次。以未發(fā)酵蘋果渣原料為對照組（CK）。

1.2.3 固態(tài)發(fā)酵

稱取A、B發(fā)酵原料各50.0 g裝入650 ml組培瓶中，按干原料∶水=1∶2加100 ml自來水，不滅菌；按1.2.2方案分別接入復(fù)合發(fā)酵劑GcAn或YAn復(fù)合懸液6 ml，充分混勻，28℃培養(yǎng)72 h，40℃烘干，粉碎過篩備用。

1.2.4 氨基酸含量測定

發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸總量測定：稱取1.2.3過程制備的發(fā)酵產(chǎn)物1.000 g放入水解管中，加6 mol/l鹽酸10 ml，3～4滴新蒸餾苯酚，110 ℃水解22 h，冷卻、過濾、定容。吸取濾液1 ml于5 ml容量瓶，40℃真空干燥，殘留物用1 ml去離子水溶解，再干燥，反復(fù)進行兩次，最后蒸干，用1 ml pH值2.2的緩沖液溶解備用。

水溶性氨基酸測定：稱取1.2.3過程制備樣品1.500 g于小三角瓶中，加5%三氯乙酸50 ml，加蓋小漏斗在水浴鍋上沸浴，維持15 min，充分搖勻過濾，收集濾液備用。

以上樣品中氨基酸含量均用L-8900氨基酸分析儀測定。

1.2.5 結(jié)果計算

氨基酸發(fā)酵增率（⊿f）、玉米漿氨基酸增率（⊿B）采用下式計算：

式中

：Cck——未發(fā)酵蘋果渣氨基酸總量(g/kg)或水溶性氨基酸含量(mg/kg);

Cf——原料發(fā)酵產(chǎn)物氨基酸總量(g/kg)或水溶性氨基酸含量(mg/kg)；

CA——原料A發(fā)酵產(chǎn)物氨基酸總量(g/kg)或水溶性氨基酸含量(mg/kg);

CB——原料B發(fā)酵產(chǎn)物氨基酸總量(g/kg)或水溶性氨基酸含量(mg/kg)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵產(chǎn)物氨基酸總量及影響因素

2.1.1 發(fā)酵劑(見表1)

由表1可知，接種復(fù)合發(fā)酵劑GcAn、YAn后其發(fā)酵產(chǎn)物的氨基酸含量大幅度增加。原料A發(fā)酵產(chǎn)物的氨基酸總量為49.48、66.54 g/kg；基本氨基酸含量為26.43、40.64 g/kg；必需氨基酸含量的增加幅度分別為34.9%～191.3%、46.3%～197.1%；基本氨基酸（除GcAn谷氨酸外）增幅分別為30.8%～95.4%、48.4%～125.2%。蛋氨酸分別增加191.3%、197.1%，精氨酸分別增加73.6%、102.9%。

表1 蘋果渣發(fā)酵產(chǎn)物氨基酸總量

在原料B中，接種發(fā)酵劑GcAn、YAn發(fā)酵產(chǎn)物的氨基酸總量增加86.2%、83.2%，必需氨基酸增加78.2%、70.7%及基本氨基酸增加91.7%、92.0%，除谷氨酸、胱氨酸、丙氨酸及蛋氨酸外，其他氨基酸增率大致相同。由表中數(shù)據(jù)可知，在原料A中發(fā)酵劑YAn效果優(yōu)于GcAn，而在原料B中兩種發(fā)酵劑無明顯差異。

2.1.2 玉米漿(見表2)

從表2中的⊿B數(shù)值看出，在GcAn接菌處理中，加入玉米漿對發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸總量影響較大。加玉米漿后，發(fā)酵產(chǎn)物的必需氨基酸增加11.8%～32.4%；除丙氨酸外，基本氨基酸增加11.0%～1 068.2%，其中谷氨酸含量較未加玉米漿對照組增加1 068.2%。在接種YAn處理中，加入玉米漿對發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸總量影響不大，有5種必需氨基酸及3種基本氨基酸含量減少，其中蛋氨酸含量下降91.4%，其余氨基酸下降0.3%～4.5%。試驗結(jié)果說明玉米漿對GcAn影響較大，而YAn不受其影響。

表2 玉米漿對發(fā)酵產(chǎn)物氨基酸總量的影響(⊿B，%)

2.2 水溶性氨基酸含量及影響因素

2.2.1 發(fā)酵劑(見表3)

從表3可知，蘋果渣經(jīng)固態(tài)發(fā)酵后水溶性氨基酸種類變化很大。8種在蘋果渣原料中未檢出的氨基酸，有7種在發(fā)酵產(chǎn)物中檢出。在發(fā)酵后新增加的7種氨基酸中，3種必需氨基酸分別為異亮氨酸、蘇氨酸及蛋氨酸；4種基本氨基酸分別為丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸及絲氨酸。另外，與發(fā)酵原料蘋果渣相比，發(fā)酵后水溶性組氨酸消失。

表3 蘋果渣發(fā)酵產(chǎn)物水溶性氨基酸含量

在接種GcAn發(fā)酵劑時，原料A、B發(fā)酵產(chǎn)物的水溶性氨基酸總量較原料(對照組)分別增加181.5%、305.0%，水溶性必需氨基酸較原料對照分別增加518.6%、637.4%，水溶性基本氨基酸較原料對照組分別增加143.3%、267.3%，其中，基本氨基酸中的谷氨酸及必需氨基酸中的亮氨酸增幅最大，分別為1 535.1%、1 688.1%及1 447.8%、1 096.6%。接種YAn發(fā)酵劑時，原料A、B發(fā)酵產(chǎn)物中的水溶性氨基酸總量較原料(對照組)分別增加215.1%、272.0%，水溶性必需氨基酸量較原料對照組分別增加466.6%、675.4%，其中有7種(酪氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸)、10種氨基酸（丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、纈氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸）含量低于GcAn接種處理。由此可知，除天門冬氨酸、脯氨酸和組氨酸外，2種發(fā)酵劑均可增加蘋果渣中所余14種水溶性氨基酸的含量，其中，水溶性谷氨酸、亮氨酸、纈氨酸的含量增加尤為明顯。單從水溶性氨基酸含量的角度考慮，以原料A、B為發(fā)酵基質(zhì)進行發(fā)酵時，接種GcAn復(fù)合發(fā)酵劑時效果較好。

2.2.2 玉米漿(見表4)

表4 玉米漿對發(fā)酵產(chǎn)物水溶性氨基酸含量的影響(⊿B，%)

由表4可知，加入玉米漿后可使發(fā)酵產(chǎn)物中的水溶性氨基酸含量出現(xiàn)不同變化，而種類無變化。如接種YAn發(fā)酵劑時，水溶性必需氨基酸及水溶性基本氨基酸總含量均增加，除去5種末檢出氨基酸，其余12種氨基酸，8種水溶性氨基酸含量增加，其中4種必需氨基酸增加29.8%～75.0%；4種水溶性氨基酸含量減少，其中3種必需氨基酸減少6.3%～14.2%。在接種發(fā)酵劑GcAn時，也有類似趨勢。說明玉米漿的加入使水溶性氨基酸總量略有增加，對各種水溶性氨基酸的含量影響不一，對水溶性氨基酸的種類無影響。

3 結(jié)論與討論

本研究表明，采用2種復(fù)合發(fā)酵劑均能顯著提高蘋果渣發(fā)酵產(chǎn)物的氨基酸總量及水溶性氨基酸含量，增加某些水溶性氨基酸種類，改善蘋果渣發(fā)酵飼料的營養(yǎng)品質(zhì)。其中蛋氨酸、精氨酸、亮氨酸及纈氨酸等動物必需氨基酸或水溶性必需氨基酸含量增加對營養(yǎng)品質(zhì)的改善意義更大。兩種發(fā)酵劑的發(fā)酵產(chǎn)物在氨基酸總量上無明顯差異。

本研究采用酵母、白地霉與黑曲霉組成的復(fù)合發(fā)酵劑對蘋果渣進行混菌發(fā)酵。發(fā)酵劑中的黑曲霉主要用于產(chǎn)生纖維素酶、果膠酶、糖化酶及等水解酶，將蘋果渣中的大分子碳水化合物水解為小分子糖類供酵母菌生長，以合成單細胞蛋白；酵母菌及白地霉主要用于利用水解產(chǎn)生的小分子糖類及加入的尿素氮合成單細胞蛋白質(zhì)。即復(fù)合發(fā)酵劑利用黑曲霉與酵母菌或白地霉共同作用將底物中的非蛋白氮轉(zhuǎn)化為菌體蛋白。此外，黑曲霉還能合成蛋白酶，將蘋果渣中的植物性蛋白質(zhì)及發(fā)酵產(chǎn)物中的部分單細胞蛋白水解為氨基酸，增加水溶性氨基酸種類及含量。因此，發(fā)酵產(chǎn)物中的氨基酸總量與微生物菌體的生長及單細胞蛋白質(zhì)數(shù)量有關(guān)，其中的水溶性氨基酸含量與發(fā)酵產(chǎn)物中植物性蛋白質(zhì)及微生物蛋白質(zhì)水解有關(guān)。在不同的發(fā)酵劑組合中，水溶性氨基酸種類及含量差異很大，其含量取決于植物及菌體蛋白質(zhì)的酶解量與水解釋放的氨基酸被微生物利用的程度。

試驗方案中向發(fā)酵原料中加入玉米漿的目的是改善發(fā)酵原料中微生物的營養(yǎng)條件，促進微生物的生長繁殖，特別是提高產(chǎn)酶真菌生長及胞外酶的合成與分泌，促進對蘋果渣中大分子碳水化合物水解及單細胞蛋白質(zhì)的合成，提高發(fā)酵產(chǎn)物中單細胞蛋白數(shù)量、動物必需氨基酸數(shù)量及水溶性氨基酸含量。玉米漿發(fā)酵產(chǎn)物的氨基酸總量及水溶性氨基酸總量在接種兩種發(fā)酵劑時均增加，其中接種白地霉+黑曲霉發(fā)酵劑時9種必需氨基酸總量的增幅達到11.8%～32.4%，即加入玉米漿對發(fā)酵產(chǎn)物的品質(zhì)提高作用顯著，但也應(yīng)注意到，少數(shù)氨基酸含量減少。

蘋果渣發(fā)酵飼料的氨基酸含量雖有報道[7-8]，但對發(fā)酵產(chǎn)物中的水溶性氨基酸變化缺乏研究，不同發(fā)酵劑及原料組成對發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸含量的影響亦不清楚。本研究將為蘋果渣發(fā)酵飼料的營養(yǎng)評價提供較為系統(tǒng)的氨基酸資料。