蜂王漿主蛋白1低聚體的分離純化及其圓二色譜分析

張 新，張紅城，董 捷，張根生*

蜂王漿主蛋白1低聚體的分離純化及其圓二色譜分析

張 新1,2，張紅城2，董 捷2，張根生1,*

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工中心蜂產(chǎn)品加工分中心，北京 100093）

蜂王漿主蛋白1（major royal jelly protein 1，MRJP1）是蜂王漿主蛋白家族中最重要的成員之一，MRJP1存在單體和低聚體兩種形式。為了研究MRJP1低聚體的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息，首先利用ToyoScreen GigaCap Q-650M離子交換柱從新鮮蜂王漿中純化出MRJP1低聚體，經(jīng)分析超速離心和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)鑒定其為MRJP1低聚體后，再通過(guò)圓二色譜技術(shù)檢測(cè)MRJP1低聚體在不同濃度Ca2+條件下（10、50、200 mmol/L）二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化情況，并測(cè)定其變性溫度。結(jié)果表明：該分離方法可以一步純化出MRJP1低聚體，MRJP1低聚體的二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊占比最高（55%左右），其次是無(wú)規(guī)卷曲（20%左右）和α-螺旋（15%左右），β-轉(zhuǎn)角（10%左右）含量最低；MRJP1低聚體的變性溫度為55 ℃。實(shí)驗(yàn)提出了MRJP1低聚體新的純化方法及其二級(jí)結(jié)構(gòu)的基本信息。

蜂王漿；MRJP1；純化；圓二色譜

蜂王漿（royal jelly，RJ）是5～15 日齡工蜂舌腺和上顎腺所分泌的乳白色或淡黃色乳狀液體，主要用于飼喂蜂王及3 日齡內(nèi)的蜜蜂幼蟲(chóng)，是蜂王幼蟲(chóng)整個(gè)發(fā)育期和雄蜂幼蟲(chóng)前期的唯一食物[1-2]。蜂王漿具有多種生物功能，如抗氧化[3]、抗腫瘤[4-5]、抗菌[6]、降血壓[7]、降血脂[8]以及對(duì)糖尿病有一定 的治療作用[9]等。

新鮮蜂王漿中蛋白質(zhì)含量豐富，占蜂王漿總量的12%～15%。蜂王漿中的蛋白質(zhì)包括水溶性蛋白和水不溶性蛋白，其中水溶性蛋白占蜂王漿蛋白的46%～89%，為蜂王漿蛋白的主要組成，故稱(chēng)為蜂王漿主蛋白（major royal jelly proteins，MRJPs）家族[10-12]。MRJPs作為一個(gè)蛋白質(zhì)家族，目前已被鑒定出10個(gè)家族成員，它們包括MRJP1～9、MRJPψ[13]。MRJPs被報(bào)道具有多種生物學(xué)功能和保健功效，如參與了蜜蜂的級(jí)型分化[14]，在幼蟲(chóng)的發(fā)育過(guò)程中提供可利用的氮元素，以及在蜜蜂行為調(diào)控中起一定作用、促進(jìn)細(xì)胞增殖、高效的抗菌活性、較強(qiáng)的免疫活性和抗氧化活性等[15-16]。MRJP1在蜂王漿蛋白中含量最為豐富，占蜂王漿水溶性蛋白的48%，等電點(diǎn)為4.0～6.3，在蜂王漿中呈現(xiàn)單體和低聚體兩種形式。MRJP1在不同的生物系統(tǒng)內(nèi)顯示出不同的生物活性，如MRJP1能刺激人淋巴細(xì)胞在無(wú)血清的培養(yǎng)基里生長(zhǎng)，也能促進(jìn)小鼠肝細(xì)胞的增殖能力，并表現(xiàn)出一定的抗疲勞功效[17-18]。Kamakura等[19]通過(guò)研究首次指出蜂王漿中的MRJP1單體是蜜蜂級(jí)型分化的主要決定因子。由于MRJPs家族中各個(gè)成員之間的生理活性功能不盡相同，所以有必要針對(duì)MRJPs中的單一蛋白成分——尤其是MRJP1低聚體，進(jìn)行分離純化研究。

MRJPs家族各個(gè)蛋白成員之間的等電點(diǎn)和分子質(zhì)量都較為接近，分離純化比較困難。迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)MRJP1的分離純化方法，主要集中于離子交換和凝膠過(guò)濾層析。Schmitzová等[11]利用DEAE-52離子交換柱，經(jīng)兩次上柱，分離出MRJP1、2兩種蛋白，由于其反復(fù)分離，導(dǎo)致蛋白損失過(guò)多，得率低；Simúth[1]用超速離心和凝膠過(guò)濾相結(jié)合的方法分離鑒定出MRJP1單體和低聚體；Tamura等[20]用Superose 12凝膠柱和Mini Q陰離子交換柱分離得到了MRJP1低聚體，然而因其使用兩種柱子相結(jié)合的方式，所以同樣出現(xiàn)蛋白損失問(wèn)題；Cruz等[21]只采用Mono Q柱分離純化出MRJP1和MRJP2，但是并沒(méi)有鑒定出此MRJP1為單體還是低聚體。因此有必要研究出一種簡(jiǎn)單的MRJP1低聚體的分離純化方法，從而可以得到足夠的MRJP1低聚體進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究。

圓二色譜（circular dichroism，CD）是研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的常用方法，它是利用偏振光在通過(guò)光學(xué)活性物質(zhì)后某些性質(zhì)發(fā)生變化來(lái)了解分子本身的結(jié)構(gòu)及其變化的技術(shù)。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲等在其各自特定的波長(zhǎng)下都對(duì)應(yīng)有不同的CD譜型，通過(guò)CD可以獲得蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息和了解構(gòu)象的變化[22-23]。圓二色譜分為同步輻射真空紫外圓二色譜（synchrotron radiation circular dichroism，SRCD）和普通CD，它們最大的區(qū)別在于波長(zhǎng)范圍不同。SRCD比CD有進(jìn)一步的優(yōu)越性，SRCD的波長(zhǎng)可向短波方向的近紫外區(qū)拓展到160 nm，其優(yōu)點(diǎn)是伴隨新的電子躍遷，對(duì)應(yīng)有新的光譜結(jié)構(gòu)，所包含的結(jié)構(gòu)信息就越豐富，所確定的結(jié)構(gòu)就越精確[24]。Biliková等[25]利用CD技術(shù)測(cè)定蜂王漿蛋白中Apisimin的二級(jí)結(jié)構(gòu)與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果一致；Cruz等[21]利用CD研究發(fā)現(xiàn)，2 mmol/L的Ca2+的存在使得MRJP1單體的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有極高的穩(wěn)定性。

本實(shí)驗(yàn)擬利用陰離子交換層析篩選優(yōu)化，得到一種簡(jiǎn)單的分離MRJP1低聚體的方法，并采用分析超速離心和質(zhì)譜共同對(duì)其進(jìn)行鑒定。此外，實(shí)驗(yàn)中還利用SRCD技術(shù)探究不同Ca2+濃 度對(duì)MRJP1低聚體二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的影響，及測(cè)定MRJP1低聚體的變性溫度（Tm）。為下一步研究MRJP1低聚體的生理活性功能以及其在貯存條件下結(jié)構(gòu)變化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂王漿樣品采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所育蜂基地，采收后置于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

氨基丁三醇（Tris） 美國(guó)Sigma公司；鹽酸、氯化鈉 北京化工廠；H2O2天津市華東試劑廠；聚丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、考馬斯亮藍(lán)R-250 北京索來(lái)寶（Solarbio）試劑公司；Marker 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

北京同步輻射真空紫外圓二色譜裝置 中國(guó)科學(xué)院高能物理研究所；AKTA Purifier 100全自動(dòng)層析儀 美國(guó)GE Healthcare公司；離子交換柱ToyoScreen GigaCap Q-650M（5 mL） 日本東曹 生物科技有限公司；Sorvall Biofuge Startos型離心機(jī) 德國(guó)Thermo Scientific公司；HPLC1100 美國(guó)Agil ent公司；LCQ Deca XP電噴霧質(zhì)譜 美國(guó)T hermo Fisher公司；Mini-Protean II型電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；Beckman/Coulter/XL-I型分析超速離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；PL303型電子分析天平、SevenEasy型pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Amicon Ultra超濾管（30 ku） 美國(guó)Millip ore公司。

1.3 方法

1.3.1 MRJP1的分離純化

新鮮蜂王漿1.0 g溶于10 mL緩沖液（30 mmol/L Tris-HCl，pH 9.0），充分?jǐn)嚢枞芙饣靹蚝?，? ℃、15 000×g離心30 min。取上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，濾液即為蜂王漿粗提液。使用陰離子交換層析對(duì)蜂王漿進(jìn)行分離純化，將ToyoScreen GigaCap Q-650M柱與AKTA purifier 100全自動(dòng)層析儀連接，由Unicron 5.2操作系統(tǒng)調(diào)控。蜂王漿粗提液通過(guò)注射器經(jīng)2.0 mL上樣環(huán)手動(dòng)上樣，起始緩沖液A（30 mmol/L Tris-HCl，pH 9.0），洗脫緩沖液B（30 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L NaCl，pH 9.0），使用起始緩沖液A對(duì)整個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行平衡后，再使用0～50%洗脫緩沖液B進(jìn)行線性洗脫100 mL，流速為2.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，洗脫樣品由AKTA purifier以每管1.0 mL自動(dòng)收集，4 ℃保存?zhèn)溆?。收集的樣品使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的分離膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）鑒定，并檢測(cè)蛋白的純度和分子質(zhì)量。

1.3.2 MRJP1低聚體的分析超速離心

分析超速離心主要是利用沉降速度來(lái)測(cè)定分子質(zhì)量。采用Beckman/Coulter/XL-I分析超速離心機(jī)，溫度為20 ℃，用照相方式記錄樣品粒子在高速離心下的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，計(jì)算出粒子的沉降系數(shù)，將其代入Svedberg方程式，可求出分子或粒子的分子質(zhì)量。MRJP1低聚體樣品溶于緩沖溶液（30 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH 9.0），上樣濃度為1、2 μmol/L，轉(zhuǎn)速為40 000×g。緩沖液的密度和黏度，蛋白質(zhì)的微分比容通過(guò)SEDNTERP程序獲得。沉降速率和沉降平衡的數(shù)據(jù)通過(guò)SEDFIT和EDPHAT程序分析。

1.3.3 MRJP1低聚體的質(zhì)譜鑒定

將分離得到的純化蛋白濃縮至2 mg/mL后取100 μL，加入100 μg胰蛋白酶，輕柔混合均勻后，在37 ℃條件下酶切過(guò)夜。取30 μL酶解產(chǎn)物直接上樣進(jìn)行質(zhì)譜分析。使用Zorbax SB C18色譜柱，ESI電噴霧離子源噴霧電壓4.5 kV，加熱電壓25 V，離子導(dǎo)入電壓20 V，離子傳輸毛細(xì)管溫度300 ℃，掃描范圍m/z 50～2 000，碰撞能量為35%，質(zhì)譜信號(hào)為多次累加掃描。采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物作外標(biāo)標(biāo)定多肽質(zhì)譜峰峰位，最后通過(guò)Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)得到的多肽片段與蜂王漿蛋白進(jìn)行檢索鑒定。

1.3.4 MRJP1低聚體的CD分析

將MRJP1低聚體溶液置于30 ku超濾管中，利用反復(fù)濃縮的方法將Tris-HCl緩沖液替換成磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 8.0），用0.22 μm濾膜過(guò)濾后，根據(jù)儀器響應(yīng)水平將蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度調(diào)整為5 mg/mL。首先，分別添加不同濃度的Ca2+（10、50、200 mmol/L），并設(shè)置對(duì)照組（0 mmol/L）為不加Ca2+的天然MRJP1低聚體。研究Ca2+濃度對(duì)MRJP1二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響；由于α-螺旋在222 nm波長(zhǎng)處有負(fù)特征吸收峰，因此本實(shí)驗(yàn)選擇222 nm波長(zhǎng)來(lái)檢測(cè)MRJP1低聚體的Tm值。

貯存環(huán)的電子能量為1.5 GeV，束流強(qiáng)度為450 mA。波長(zhǎng)掃描范圍為175～260 nm，步長(zhǎng)1.0 nm，CaF2樣品池厚度0.001 mm，停留時(shí)間1 min，掃描次數(shù)5 次，測(cè)量溫度為25 ℃。Tm值測(cè)定的初始檢測(cè)溫度為10 ℃，隨后每2 ℃為一個(gè)梯度，溫度依次上升至80 ℃，到達(dá)每個(gè)溫度穩(wěn)定5 min后檢測(cè)222 nm波長(zhǎng)處CD吸收值。利用CD Tool軟件對(duì)CD譜進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，扣除對(duì)照樣品的CD信號(hào)后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行濃度、光程長(zhǎng)歸一化，分別計(jì)算α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲的含量及Tm值。

2 結(jié)果與分析

2.1 MRJP1的分離純化結(jié)果

蜂王漿粗取液里含有的MRJPs主要為MRJP1、MRJP2、MRJP3、MRJP5[11]。MRJP1、MRJP2的等電點(diǎn)為4.0～6.3、6.2～7.9；利用生物信息學(xué)查得MRJP3、MRJP5理論等電點(diǎn)分別為6.87、8.94。由于MRJPs等電點(diǎn)不同，并且大部分都是酸性蛋白，因此選擇陰離子交換法來(lái)分離蜂王漿蛋白。

本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)離子交換層析過(guò)程使用的Tris-HCl緩沖液的pH 8.0、9.0、10.0和濃度10、20、30 mmol/L及不同的日本東曹公司柱材（ToyoScreen GigaCap Q-650M，ToyoScreen Q-600C AR，ToyoScreen DEAE-650M，ToyoScreen SuperQ-650M和ToyoScreen QAE-550）的選擇進(jìn)行了優(yōu)化。篩選出最適合的緩沖液為pH 9.0的30 mmol/L Tris-HCl，最優(yōu)的柱子為T(mén)oyoScreen GigaCap Q-650M柱。在此條件下，分離MRJPs的離子交換層析圖譜如圖1所示。

圖1 陰離子交換層析分離純化MRJP1的色譜圖及其電泳檢測(cè)圖Fig.1 Anion-exchange chromatography and SDS-PAGE analysis of MRJP1

由圖1可知，使用陰離子交換層析可以分離純化出MRJP1。將收集到的每個(gè)峰的組分進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，發(fā)現(xiàn)P4、P5的蛋白組分為純化單一組分，與蜂王漿粗提液和Marker分子質(zhì)量對(duì)比，初步判斷P4、P5峰均含有MRJP1。由于MRJP1為弱酸性蛋白，因此與其他弱堿性蜂王漿蛋白相比，在pH 9.0堿性分離條件下，MRJP1帶有負(fù)電荷最多，與陰離子交換柱結(jié)合最緊密，所以最后被洗脫下來(lái)，從而與其他蛋白分離開(kāi)來(lái)。研究表明MRJP1是分子質(zhì)量約為49～60 kD的弱酸性糖蛋白[11]，可以形成290～420 kD的低聚體[1,25-26]；由于低聚體在此緩沖液下帶有的負(fù)電荷比單體多，因此推測(cè)P4組分可能為單體，P5組分可能為低聚體。P0～P3中并無(wú)MRJP1出現(xiàn)，說(shuō)明MRJP1完全被分離開(kāi)。

2.2 MRJP1低聚體質(zhì)譜鑒定

為進(jìn)一步確認(rèn)分離純化得到的蛋白是MRJP1，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的方法對(duì)此蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。MRJP1低聚體樣品經(jīng)胰蛋白酶消化，酶切位點(diǎn)為精氨酸和賴(lài)氨酸，形成的多肽片段進(jìn)入質(zhì)譜，一級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)多肽分子的大小，然后再將肽段打碎，形成一系列離子，質(zhì)譜再檢測(cè)碎片離子的大小，即二級(jí)質(zhì)譜。被打碎的40 個(gè)多肽片段中，25 個(gè)多肽片段通過(guò)SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與蜂王漿蛋白家族的成員序列進(jìn)行匹配。其中，分子質(zhì)量較大的6 個(gè)多肽片段為NNYPSDIDQWHDK，YNGVPSSLNVISK，LLTFDLTTSQLLK，TSDYQQNDIHYEGVQNILDTQSSAK，SGVLFFGLVGDSALGCWNEHR，和IMNANVNELILNTR。其匹配情況如圖2所示，與MRJP1的匹配得分最高，且為唯一及格蛋白，序列覆蓋率為53.47%，故經(jīng)生物信息學(xué)比對(duì)結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)該蛋白為蜂王漿主蛋白成分MRJP1。

圖2 MRJP1低聚體的質(zhì)譜肽段碎片匹配情況Fig.2 Polypeptide matching of MRJP1 oligomer

2.3 MRJP1低聚體分子質(zhì)量的測(cè)定結(jié)果

將ToyoScreen GigaCap Q-650M柱分離得到的P4和P5組分，濃縮并除鹽后分別過(guò)Superdex 200凝膠過(guò)濾層析，發(fā)現(xiàn)P4組分含有雙峰，含有MRJP1單體和低聚體；P5組分為單峰，其主成分為MRJP1低聚體。為了進(jìn)一步驗(yàn)證P5組分為低聚體，對(duì)樣品進(jìn)行了分析超速離心來(lái)測(cè)定其分子質(zhì)量。通過(guò)拍照得到的沉降系數(shù)等數(shù)據(jù)通過(guò)SEDFIT和EDPHAT程序分析，即可得到樣品中粒子的分子質(zhì)量。

圖3 P5組分中MRJP1低聚體分析超速離心實(shí)驗(yàn)譜圖Fig.3 Identification of MRJP1 oligomer from P5 fraction by sedimentation equilibrium

如圖3所示，分析超速離心實(shí)驗(yàn)主峰對(duì)應(yīng)的分子質(zhì)量約為238 kD，由于MRJP1的分子質(zhì)量約為49～60 kD[6]，Tamura等[14]通過(guò)雙向電泳將MRJP1低聚體分成55、5 kD兩部分，因此推測(cè)此238 kD的MRJP1低聚體很可能為四聚體，即由4 個(gè)MRJP1單體和4 個(gè)5 kD單體組成了MRJP1低聚體。

2.4 MRJP1低聚體的CD分析

2.4.1 不同Ca2+濃度對(duì)MRJP1低聚體二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

表1 MRJP1低聚體二級(jí)結(jié)構(gòu)隨Ca2+濃度變化情況Table 1 Changes in secondary structures of MRJP1 oligomer in the presence of Ca2+ at various concentrations

MRJP1低聚體通過(guò)SRCD分析，用CD Tool和CD SSTR算法處理其圖譜。如表1所示，得到天然MRJP1低聚體的二級(jí)結(jié)構(gòu)比例，其中，β-折疊所占比例最高（54.4%左右），其次是無(wú)規(guī)卷曲（19.8%左右）和α-螺旋（13.1%左右），β-轉(zhuǎn)角（12.6%左右）含量最低。劉娟[27]研究新鮮蜂王漿蛋白中，β-折疊結(jié)構(gòu)占26.7%，α-螺旋結(jié)構(gòu)占22.8%，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)占23.7%，不規(guī)則結(jié)構(gòu)占16.7%，其結(jié)構(gòu)比例接近1∶1∶1∶1。MRJP1在蜂王漿蛋白中含量接近1/2，而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MRJP1低聚體中，β-折疊結(jié)構(gòu)高達(dá)50%以上，故推測(cè)蜂王漿中β-折疊結(jié)構(gòu)，主要來(lái)自MRJP1低聚體，其他蛋白含有的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角所占比例會(huì)較高。

在3 種Ca2+濃度（10、50、200 mmol/L）條件下，MRJP1低聚體的二級(jí)結(jié)構(gòu)比例與對(duì)照組相差不大，即Ca2+的濃度對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)比例影響不大，隨Ca2+濃度的升高，α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角所占比例稍有降低，無(wú)規(guī)卷曲所占比例略有增加。Cruz等[21]研究2 mmol/L Ca2+對(duì)MRJP1結(jié)構(gòu)的影響不大，而本實(shí)驗(yàn)在高Ca2+濃度的情況下，MRJP1低聚體總體結(jié)構(gòu)變化依然很小，說(shuō)明Ca2+濃度對(duì)MRJP1低聚體二級(jí)結(jié)構(gòu)確實(shí)影響不大。

2.4.2 MRJP1低聚體的Tm值

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液被逐漸加熱并超過(guò)臨界溫度時(shí)，溶液中的蛋白質(zhì)將發(fā)生從天然狀態(tài)向變性狀態(tài)的劇烈轉(zhuǎn)變，此轉(zhuǎn)變溫度被稱(chēng)作變性溫度（Tm），此時(shí)蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)和變性狀態(tài)的濃度之比為1∶1。由圖4可知，MRJP1低聚體的Tm值約為55 ℃，表明MRJP1低聚體在55 ℃前熱穩(wěn)定性很好，其二級(jí)結(jié)構(gòu)基本上沒(méi)有變化；55 ℃以后，二級(jí)結(jié)構(gòu)逐漸變化，熱穩(wěn)定性變差。因此，蜂王漿在低溫和常溫貯藏過(guò)程中，MRJP1低聚體的結(jié)構(gòu)一般不會(huì)發(fā)生變化。Simúth[1]發(fā)現(xiàn)MRIP1低聚體在37 ℃條件下貯藏12 h后仍無(wú)降解跡象；Kamakura等[18]發(fā)現(xiàn)MRJP1低聚體在40 ℃條件下保存30 d后只降解10%；Tamura等[20]指出，MRJP1低聚體高級(jí)結(jié)構(gòu)在56 ℃環(huán)境下保持30 min也不會(huì)有大的改變。這些結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)測(cè)得MRJP1低聚體的變性溫度為55 ℃相符，低于變性溫度情況下MRJP1低聚體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

圖4 MRJP1低聚體熱變性圖Fig.4 Thermal denaturation curve of MRJP1 oligomer

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)蜂王漿蛋白的性質(zhì)，使用ToyoScreen GigaCap Q-650M陰離子交換柱優(yōu)化出一種新的分離MRJP1低聚體的方法，相對(duì)于其他需要至少兩種柱層析方法更方便高效。在對(duì)蜂王漿進(jìn)行前處理過(guò)程中，前人大多采用透析的方式，需要消耗2～3 d；而本實(shí)驗(yàn)對(duì)蜂王漿的前處理只需要30 min，純化過(guò)程也在1 h內(nèi)完成，既節(jié)省了步驟，也節(jié)約了時(shí)間，適合大規(guī)模純化MRJP1低聚體，從而進(jìn)行功能性質(zhì)的研究。為了鑒定此MRJP1為低聚體，本實(shí)驗(yàn)首次采用分析超速離心來(lái) 精確測(cè)定其分子質(zhì)量為238 kD，并推測(cè)其為MRJP1四聚體。隨后，本實(shí)驗(yàn)利用SRCD技術(shù)研究MRJP1低聚體二級(jí)結(jié)構(gòu)，β-螺旋所占比例最高，均占55%左右；其次是無(wú)規(guī)卷曲和α-螺旋，分別約占20%和15%；β-轉(zhuǎn)角含量最低，占10%左右。并測(cè)定MRJP1低聚體的變性溫度為55 ℃。

總之，本實(shí)驗(yàn)提出了MRJP1低聚體新的純化方法及其二級(jí)結(jié)構(gòu)的基本信息，為下一步研究MRJP1低聚體的生理活性功能以及其在貯藏存條件下結(jié)構(gòu)變化打下了基礎(chǔ)。

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Purification and Circular Dichroism Analysis of MRJP1 Oligomer from Royal Jelly

ZHANG Xin1,2, ZHANG Hong-cheng2, DONG Jie2, ZHANG Gen-sheng1,*
(1. College of Food Science, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China; 2. National R&D Centre for Bee Product Processing, Ministry of Agriculture, Bee Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China)

MRJP1 is one of the most important members in the Major Royal Jelly Proteins (MRJPs) family with monomeric and oligomeric forms in royal jelly. In order to investigate the secondary structure of RJP1 oligomer, MRJP1 oligomer was extracted from fresh royal jelly and purified by ToyoScreen GigaCap Q-650M anion exchange column, then identified by sedimentation equilibrium and liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Afterwards, we detected MRJP1 oligomer by synchrotron radiation circular dichroism (SRCD) to clarify the correlation between its secondary structure and different con centration of Ca2+(10, 50 and 200 mmol/L). In addition, its Tmvalue was also determined. The results showed that the proportion of β-strand (about 55%) was the highest, followed in decreasing order by random coil (20%) and α-helix (15%) and β-turns (10%). Ca2+had little effect on the secondary structure of MRJP1 oligomer. The Tmvalue of MRJP1 oligomer was 55 ℃. To conclude, a new method for the purification of MRJP1 oligomer and information on its secondary structure have been presented in this study.

royal Jelly; MRJP1; purification; circular dichroism (CD)

TS201.2

A

1002-6630（2014）17-0063-05

10.7506/spkx1002-6630-201417013

2013-11-10

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（蜂）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（CARS-45-KXJ18）；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)（2012ZL074）

張新（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)閭鹘y(tǒng)食品工業(yè)化。E-mail：249193138@qq.com

*通信作者：張根生（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。E-mail：zhanggsh@163.com