雞樅菌ITS區(qū)克隆、測(cè)序及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

龍 梅，郭 放，郭莉娟，何雪梅，劉小艷，李 蓓，羅 燕，鄒立扣,*

雞樅菌ITS區(qū)克隆、測(cè)序及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

龍 梅1,2，郭 放1，郭莉娟1,2，何雪梅1,2，劉小艷1，李 蓓1，羅 燕1，鄒立扣1,2,*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，四川 成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)都江堰校區(qū)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，森林資源保護(hù)與利用 實(shí)驗(yàn)室，四川 都江堰 611830）

采集雞樅菌（Termitomyces）子實(shí)體，對(duì)其進(jìn)行rDNA-ITS 區(qū)序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增測(cè)序，利用MEGA5對(duì)rDNA-ITS不同區(qū)域作序列分析，并構(gòu)建雞樅菌轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明：在10種雞樅菌中，測(cè)序結(jié)果表明雞樅菌rDNA-ITS區(qū)長(zhǎng)度在527～661 bp。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，10種雞樅菌中，有8種雞樅菌各為一支，尖盾雞樅菌與球蓋白蟻傘聚為一支；待定種A1、E1、H1獨(dú)為一支，可能為新種；B1、G1、D1可能為谷堆雞樅菌；I1可能為根白蟻傘；ZZ1可能為粗柄雞樅菌；待定種C1不能明確。結(jié)果證明，ITS1及ITS1-5.8S rDNA-ITS2可用于雞樅菌進(jìn)行種間系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立，但I(xiàn)TS1區(qū)構(gòu)建的雞樅菌種間系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)支持率最高，ITS2區(qū)可輔助進(jìn)行某些待定種的鑒定。

雞樅菌；系統(tǒng)發(fā)育；ITS序列

雞樅菌（Termitomyces spp.）又稱(chēng)傘把菇、蟻巢傘、雞絲菇等，屬傘菌目，口蘑科，是一種營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美的珍貴野生食用菌。雞樅菌蛋白質(zhì)含量高，含有多種微量元素，且具有抗氧化、鎮(zhèn)痛抗炎的作用[1-3]。多年來(lái)多次在西昌、巴中、洪雅、資中、大邑等地采集大量新鮮雞樅菌子實(shí)體，通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定對(duì)四川省雞樅菌種類(lèi)進(jìn)行記述[4]。在形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)的基礎(chǔ)上多次對(duì)雞樅菌及其內(nèi)生真菌有過(guò)報(bào)道[5-7]。雞樅菌多糖、氨基酸含量均較高，本研究曾對(duì)10 種雞樅菌進(jìn)行氨基酸含量的分析，發(fā)現(xiàn)其總氨基酸含量高達(dá)28.86%，必需氨基酸含量在7.08%～10.20%[8-9]。

雞樅菌因其與白蟻共生關(guān)系的復(fù)雜性，目前尚未能成功馴化栽培[10]。因此，從其他途徑分析雞樅菌的生長(zhǎng)有重要意義。近年來(lái)，分子生物學(xué)的方法越來(lái)越多地應(yīng)用于真菌的系統(tǒng)學(xué)研究及分類(lèi)鑒定中。但是，對(duì)于雞樅菌的系統(tǒng)學(xué)研究，國(guó)外僅少數(shù)報(bào)道，國(guó)內(nèi)僅個(gè)別報(bào)道。Rouland-Lefevre等[11]首次采用分子生物學(xué)手段對(duì)雞樅菌及與其共生的白蟻種群轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）結(jié)合分析，建立雞樅菌屬與其共生系統(tǒng)（白蟻）之間的進(jìn)化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)雞樅菌種群是單源進(jìn)化的，屬于口蘑科（Tricholomataceae）。經(jīng)對(duì)蟻巢傘的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和大白蟻亞科的生物分類(lèi)樹(shù)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，在一定條件下，雞樅菌和白蟻是協(xié)同進(jìn)化的。Fr?slev等[12]對(duì)Nlsu-rDNA和mtSSU-rDNA序列經(jīng)Bayesian、Maximum Likelihood及最大簡(jiǎn)約性分析，討論了雞樅菌屬與相關(guān)類(lèi)群之間及雞樅菌屬種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，發(fā)現(xiàn)雞樅菌是一個(gè)自然單系群。付子艷等[13]經(jīng)分子系統(tǒng)學(xué)對(duì)云南產(chǎn)雞樅進(jìn)行ITS區(qū)分析，云南雞樅菌也是自然單系群，發(fā)現(xiàn)華雞樅菌屬真菌與雞樅菌屬真菌有較密切的親緣關(guān)系。四川省是國(guó)內(nèi)雞樅菌的主要產(chǎn)地之一，對(duì)四川雞樅菌的分類(lèi)及分子發(fā)育等研究具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)共收集了四川省內(nèi)10多種雞樅菌，確定種類(lèi)有10 種，據(jù)報(bào)道目前全世界已知雞樅菌有25 種[7]，占世界種類(lèi)的40%。本實(shí)驗(yàn)對(duì)雞樅種內(nèi)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，弄清雞樅菌進(jìn)化關(guān)系，旨在為雞樅菌的進(jìn)一步馴化栽培提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 雞樅菌的采集與鑒定

雞樅菌子實(shí)體采集時(shí)間為每年的6—9月，采集地為西昌、洪雅、資中、大邑、巴中。采集時(shí)拍攝照片，記錄雞樅菌子實(shí)體顏色，描述雞樅菌形態(tài)學(xué)特征，包括其菌柄長(zhǎng)度，菌柄直徑，菌蓋周長(zhǎng)等。測(cè)量其根部距蟻巢的距離、蟻巢處土壤pH值、周?chē)脖画h(huán)境。樣品采集后在室外接種，并用冰袋進(jìn)行保鮮，送回實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)雞樅菌子實(shí)體和產(chǎn)生的孢子進(jìn)行觀察，結(jié)合野外記錄和參考資料[14]確定雞樅菌種類(lèi)。

1.1.2 試劑

真菌通用引物ITS4/ITS5 生工生物工程（上海）股份有限公司；DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000、Taq DNA聚合酶 寶生物工程（大連）有限公司；小量膠回收試劑盒天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

JSM-5900LV型掃描電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社；Eppendorf 5804R高速冷凍離心機(jī)、Eppendorf Bio-Photometer核酸蛋白儀 德國(guó)Eppendrof公司；凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀 美國(guó) Bio-Rad公司；Leica顯微鏡 德國(guó)Leica公司；水浴鍋 上海佑柯儀器設(shè)備有限公司；小型渦旋振蕩器 德國(guó)IKA公司。

1.2 雞樅菌孢子形態(tài)特征

獲得雞樅菌孢子后，用掃描電子顯微鏡觀察其孢子形態(tài)，取孢子置于蓋玻片上，加4%戊二醛2滴固定5～10 min，用濾紙吸掉多余的水分，自然干燥[15]。在真空10 Pa，電流15 mA，時(shí)間80 s的條件下，用Hitachi離子濺射儀噴金提高樣品導(dǎo)電性。用JSM-5900LV型掃描電鏡，加速電壓20 kV。

1.3 雞樅菌子實(shí)體總DNA的提取

采用改良二次沉淀法[16]提取雞樅菌子實(shí)體總DNA。將采集自蟻巢上方的新鮮子實(shí)體用滅菌蒸餾水沖洗2～3 次后，用無(wú)菌手術(shù)剪剪取菌柄，液氮研磨2～3 次，提取DNA。將自然風(fēng)干的DNA用滅菌超純水溶解，用核酸蛋白儀測(cè)定其總DNA濃度，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢查其DNA質(zhì)量，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ITS區(qū)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增、克隆、測(cè)序

取出備用總D NA，采用真菌通用引物I T S 4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）和ITS5（5’- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG-3’）進(jìn)行菌絲體DNA ITS區(qū)擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為50 μL：40.5 μL無(wú)菌超純水，5 μL 10×Taq Reaction Buffer（含Mg2+），1 μL 10 mmol/L dNTP，1 μL ITS4，1 μL ITS5，1 μL DNA模板，0.5 μL Taq DNA 聚合酶。反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min、52 ℃退火50 s、72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳檢測(cè)后回收，連接pMD19-T載體，大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選和菌落PCR鑒定后送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，利用Clustal X 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。

1.5 ITS區(qū)序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

將測(cè)序ITS區(qū)序列在GenBank中BLAST比對(duì)，選取其中相關(guān)序列，利用DNAstar軟件分析ITS區(qū)序列特征，用Clustal X（ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/Clustal X/）對(duì)ITS區(qū)序列不同基因片段進(jìn)行比對(duì)對(duì)齊，ITS區(qū)序列結(jié)構(gòu)如圖1所示。以MEGA5（http：//www.gegasoftware.net/）分析序列的堿基組成及計(jì)算遺傳距離等，構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Kimura雙參數(shù)法計(jì)算核算距離，Bootstrap=1 000。

圖1 ITS區(qū)示意圖Fig.1 Schematic representation of ITS region

2 結(jié)果與分析

2.1 雞樅菌孢子特征

光學(xué)顯微鏡及電鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)，各種雞樅菌孢子形態(tài)、大小無(wú)差異。在光學(xué)顯微鏡下，觀察到雞樅菌孢子呈橢圓形、外緣光滑，萌發(fā)時(shí)在橢圓形的一頭形成小尖（圖2a）。在掃描電子顯微鏡下，觀察到雞樅菌孢子呈不規(guī)則橢球形，測(cè)定短直徑在3～4 μm，長(zhǎng)直徑5～7 μm，表面不光滑，有顆粒狀物質(zhì)附著（圖2b）。

圖2 雞樅菌孢子形態(tài)Fig.2 Morphology of Termitomyces spores

2.2 雞樅菌種類(lèi)

圖3 部分雞樅菌子實(shí)體形態(tài)Fig.3 Photographs of fruit bodies of some Termitomyces spp.

根據(jù)形態(tài)學(xué)特征[4]、孢子鏡檢及ITS區(qū)序列結(jié)果鑒定雞樅菌種類(lèi)主要有以下幾種：普通雞樅菌（T. albuminosus）、粗柄雞樅菌（T. rodustus）、小雞樅菌（T. microcarpus）、谷堆雞樅菌（T. heimii）、端圓白蟻傘（T. tyleranus）、根白蟻傘（T. eurrhizus）、尖盾白蟻傘（T. clypentus）、裂紋白蟻傘（T. schimperi）、球蓋白蟻傘（T. globules）、烏黑白蟻傘（T. badius）及9 個(gè)待定種雞樅菌。其中測(cè)得雞樅菌菌柄長(zhǎng)度在5～52 cm，菌柄直徑在0.5～15 cm，菌蓋直徑在2.1～38 cm，測(cè)得蟻巢pH值在5.9～6.5。部分雞樅菌種類(lèi)如圖3所示。

2.3 測(cè)序結(jié)果及序列分析

使用引物ITS4/ITS5對(duì)雞樅菌總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，在600～700 bp處得到明亮清晰的條帶，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序后分析其序列特征。GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載雞樅菌ITS區(qū)序列，與本研究種類(lèi)比較，使用ITS區(qū)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的菌株來(lái)源如表1所示。ITS不同區(qū)域長(zhǎng)度、GC含量等詳細(xì)情況如表2所示。結(jié)果表明不同種類(lèi)雞樅菌ITS區(qū)序列長(zhǎng)度不等，其中ITS區(qū)最長(zhǎng)的雞樅菌（小雞樅）與ITS區(qū)最短的雞樅菌（待定種E1）相差134 bp，其余雞樅菌ITS區(qū)序列在527～661 bp變化。

ITS1區(qū)差異較大，長(zhǎng)度在155～248 bp，其中小雞樅菌菌（T. microcarpus）和端圓白蟻傘（T. tyleranus）最長(zhǎng)，為248 bp。小雞樅GC含量最高，達(dá)到56.85%，其他雞樅菌GC含量均在40.65%～56.85%變動(dòng)。

ITS2區(qū)各種間差異較小，長(zhǎng)度在202～251 bp之間，其中，小雞樅（T. microcarpus）和待定雞樅菌（A1）最長(zhǎng)，為251 bp。待定雞樅菌（G1）GC含量最高，達(dá)到52.00%，其他雞樅菌在43.07%～52.00%變動(dòng)。

5.8 S區(qū)相對(duì)保守，各種間長(zhǎng)度在156～162 bp。但GC含量有較大差異，在42.00%～55.35%變動(dòng)，其中待定種（A1）達(dá)到最高，為55.35%。ITS區(qū)各區(qū)GC含量的變化，可能與各區(qū)的堿基長(zhǎng)度有關(guān)。

表1 用ITS區(qū)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的菌株來(lái)源Table 1 Origins of the ITS sequences used for the establishment of phylogenetic tree

表2 ITS區(qū)堿基組成及GC含量分析Table 2 Nucleotide composition and GC contents of rDNA ITS1 and ITS2 sequences of Termitomyces

生物信息學(xué)軟件分析表明，雞樅菌種類(lèi)多樣性及差異主要體現(xiàn)在ITS1區(qū)和ITS2區(qū)，由圖4可知，不同雞樅菌在ITS1及ITS2區(qū)不同部位出現(xiàn)序列缺失情況不一，因此，可重新設(shè)計(jì)不同引物進(jìn)行雞樅菌種間的PCR鑒定。

圖4 部分雞樅菌rDNA-ITS缺失序列Fig.4 Partial sequences of the missing region of rDNA-ITS in Termitomyces

2.4 雞樅菌系統(tǒng)發(fā)育分析

基于ITS1-5.8S rDNA-ITS2區(qū)全序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，雞樅菌形成兩個(gè)進(jìn)化組（圖5a），小雞樅菌和端圓白蟻傘聚為一組，Bootstrap（即支持率）值為64%；其余雞樅菌及待定雞樅菌聚為一大支，Bootstrap值為73%。在這一大支中，待定種H1、普通雞樅菌、粗柄雞樅菌、待定種ZZ1聚為一小支，其Bootstrap值均大于67%，最高為87%。剩下的雞樅菌聚為另一支，最高Bootstrap值為99%，最低為40%。

基于ITS1區(qū)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，雞樅菌形成兩個(gè)進(jìn)化組（圖5b），小雞樅菌和端圓白蟻傘聚為一支，Bootstrap值為99%。其余雞樅分化為3 支，其中標(biāo)準(zhǔn)株AB073506獨(dú)為一小支；烏黑白蟻傘、待定種H1、普通雞樅菌、待定種I1、粗柄雞樅菌聚為一小支，最高Bootstrap值為93%；剩余雞樅菌聚為第三小支，最高Bootstrap值為10v0%，最低為 36%。

基于ITS2區(qū)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，由小雞樅菌最先開(kāi)始進(jìn)化（圖5c），后分為兩級(jí)進(jìn)化，烏黑白蟻傘獨(dú)為一級(jí)；余下雞樅菌再分為兩大級(jí)進(jìn)行進(jìn)化，其中普通雞樅菌、待定種I1、H1、粗柄雞樅菌為第一級(jí)進(jìn)化，剩余雞樅菌逐級(jí)進(jìn)化，除個(gè)別Bootstrap值較高外，普遍Bootstrap值較低。

綜上所述，在種間關(guān)系中，小雞樅菌與端圓白蟻傘親緣關(guān)系較近，且由小雞樅菌開(kāi)始進(jìn)化；烏黑蟻巢傘、普通雞樅菌、粗柄雞樅菌及待定種H1、ZZ1、I1 之間親緣關(guān)系較近；待定種A1、B1、C1、D1、G1、E1及谷堆雞樅菌、裂紋白蟻傘、尖盾雞樅菌、球蓋白蟻傘親緣關(guān)系較近。在各區(qū)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，ITS1及ITS1-5.8S rDNA-ITS2可用于雞樅菌進(jìn)行種間系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立，但I(xiàn)TS1區(qū)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)支持率最高，與全序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)較為一致，可用于分析雞樅菌種間差異；ITS2區(qū)支持率一般，可輔助進(jìn)行某些待定種的鑒定。

圖5 基于rDNA-ITS 不同區(qū)域的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree based on the sequences of rDNA-ITS region

3 結(jié)論與討論

雞樅菌為一種珍貴的野生實(shí)用菌，雞樅菌營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，主要分布在我國(guó)四川、云南、貴州等省的山區(qū)，每年6—9月采摘。近年來(lái)，由于其多糖的免疫功能及降血脂、抗腫瘤等作用的發(fā)現(xiàn)，吸引了大批學(xué)者對(duì)其多糖的注意[17-20]。但雞樅菌因其與白蟻復(fù)雜的共生關(guān)系，不能人工栽培，資源不能廣泛供應(yīng)，故實(shí)現(xiàn)雞樅菌的人工馴化栽培，具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)用真菌鑒定的常規(guī)方法進(jìn)行子實(shí)體形態(tài)特征觀察和顯微鏡鑒定，根據(jù)卯曉嵐[14]的分類(lèi)描述，鑒定出10 個(gè)種，有2 個(gè)樣品根據(jù)形態(tài)學(xué)描述及顯微鏡觀察并不能將其準(zhǔn)確歸類(lèi)，另有7個(gè)樣品在采樣時(shí)因形態(tài)描述資料缺乏，均歸為待定種。本實(shí)驗(yàn)為雞樅菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系作了闡明，旨在弄清雞樅菌進(jìn)化關(guān)系，獲得新的途徑找到解決問(wèn)題的方法。

結(jié)果表明，雞樅菌ITS區(qū)GC含量與其堿基長(zhǎng)度存在一定關(guān)系（表2），小雞樅菌、粗柄雞樅菌及普通雞樅菌在ITS1區(qū)GC含量均較其他雞樅高，最高為56.85%，可見(jiàn)GC含量分析能夠提供系統(tǒng)發(fā)育信息[15]?；贗TS1-5.8S rDNA-ITS、ITS1、ITS2區(qū)不同區(qū)段對(duì)10 種確定種雞樅菌及9 種待定雞樅菌進(jìn)行種間發(fā)育關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果表明ITS1-5.8S rDNA-ITS2全序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)支持率較高，但I(xiàn)TS1支持率最高，結(jié)合其GC含量及堿基長(zhǎng)度的情況能清晰的顯示雞樅種間的差異，能夠應(yīng)用于建立雞樅菌種間系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，ITS2區(qū)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)支持率不高，可進(jìn)行輔助分析。在ITS1-5.8S rDNA-ITS2區(qū)各區(qū)建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)均可將雞樅菌各種進(jìn)行區(qū)分，可見(jiàn)能利用ITS1-5.8S rDNA-ITS2區(qū)及各區(qū)進(jìn)行雞樅菌種間鑒定及其進(jìn)化發(fā)育關(guān)系的研究。

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果表明，尖盾雞樅菌（T. clypeatus）與GenBank中下載的標(biāo)準(zhǔn)株T. clypeatus（FJ147329、FJ147331）并不聚攏一支，其ITS區(qū)差異也較大，尖盾雞樅菌ITS區(qū)長(zhǎng)度為538 bp, FJ147329、FJ147331兩標(biāo)準(zhǔn)株ITS區(qū)分別為510、514 bp?？赡苁遣煌瑖?guó)家在對(duì)雞樅菌進(jìn)行種間判定的標(biāo)準(zhǔn)不同，導(dǎo)致了不同的結(jié)果，使其在分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中不能聚攏。而尖盾雞樅菌在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中總是與球蓋白蟻傘聚為一支，說(shuō)明在分子水平上的鑒定并不能將這兩種雞樅進(jìn)行區(qū)分，有待找出新的途徑對(duì)兩種雞樅菌進(jìn)行鑒定區(qū)分。9 個(gè)待定種中，A1、E1、H1 各為一支，可能為新種；B1、G1、D1為可能為谷堆雞樅菌；C1與尖盾雞樅菌及球蓋白蟻傘聚為一支，暫不能明確；I1 為根白蟻傘；ZZ1為粗柄雞樅菌的可能性較大。待定種的確定，表明由ITS1-5.8S rDNA-ITS2 區(qū)及各區(qū)進(jìn)行雞樅菌種間鑒定及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究是可行的。

根據(jù)前期研究，比較雞樅菌的形態(tài)特征及生長(zhǎng)環(huán)境[4]，雞樅菌的聚類(lèi)可能與生長(zhǎng)環(huán)境、生長(zhǎng)方式、生長(zhǎng)地域及共生白蟻種類(lèi)有關(guān)。谷堆雞樅菌、球蓋白蟻傘、根白蟻傘、裂紋雞樅菌、尖盾雞樅菌及待定雞樅菌聚為一大支，其采集地主要為西昌及巴中，均喜生長(zhǎng)在混交林地或淺草地中，在形態(tài)特征上，如菌蓋直徑、菌柄長(zhǎng)度等的差異較小。端圓白蟻傘與小白蟻傘聚為一大支，其采集地分別為巴中、西昌，喜夏季生長(zhǎng)在落葉林地中，且均為群生、數(shù)量較多。粗柄雞樅菌、尖盾雞樅菌及普通雞樅菌聚為一大支，采集地為資中、西昌，其生長(zhǎng)環(huán)境差異較大，其中粗柄雞樅菌喜生長(zhǎng)在林緣草地或空曠處，尖盾雞樅菌喜秋季生長(zhǎng)在闊葉林下，普通雞樅菌喜混交林地草坡，其聚類(lèi)可能與共生白蟻種類(lèi)有關(guān)[11]。

本實(shí)驗(yàn)利用10 種雞樅菌及9 種待定雞樅菌，構(gòu)建四川省雞樅菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，因其種類(lèi)占世界已知種類(lèi)的40%，故深具代表性，有利于弄清四川省雞樅菌進(jìn)化關(guān)系，了解雞樅菌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。在四川各地采集雞樅菌子實(shí)體，提取其總DNA進(jìn)行ITS區(qū)的PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同種雞樅菌ITS區(qū)長(zhǎng)度不等，在527～661 bp，不同種長(zhǎng)度不一，在分子水平上揭露了雞樅菌的遺傳多樣性，為雞樅菌種類(lèi)序列多樣性增添了新內(nèi)容，提供了多種雞樅菌ITS區(qū)序列信息，有利于雞樅菌進(jìn)行分子水平上的種間鑒定，構(gòu)建了基于rDNA-ITS1不同區(qū)域的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，為四川雞樅菌系統(tǒng)發(fā)育研究提供理論基礎(chǔ)。

[1] 周繼平,許鴻瑜.雞樅菌粉不同組分的體外抗氧化活性研究[J].中國(guó)野生植物資源,2008, 27(5): 46-49.

[2] 陸奕宇, 敖宗華, 成成,等.雞樅菌粉提取物鎮(zhèn)痛抗炎作用的研究[J].中成藥, 2007, 29(12): 1742-1745.

[3] 王一心, 狄勇, 楊桂芝. 雞樅菌在大鼠高膽固醇血癥中的抗氧化作用[J].中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2005, 6(1): 10-12.

[4] 岳愛(ài)玲,張悅,姚瓊, 等.四川省雞樅菌種類(lèi)記述[J].中國(guó)食用菌,2010, 29(4): 5-7.

[5] 鄒立扣, 潘欣, 韓軍濤, 等. 雞樅菌內(nèi)生擬盤(pán)多毛孢菌的分離和培養(yǎng)及鑒定[J]. 中國(guó)食用菌, 2008, 27(5): 44-47.

[6] 鄒立扣, 潘欣, 韓軍濤, 等. 雞樅菌形態(tài)學(xué)及其分子鑒定[J]. 食用菌, 2009(2): 17-18.

[7] 鄒立扣, 潘欣. 粗柄雞樅菌總DNA提起及ITS區(qū)克隆測(cè)序研究[J]. 北方園藝, 2009(6): 217-219.

[8] 鄒立扣, 潘欣, 岳愛(ài)玲, 等. 四川省雞樅菌氨基酸組成及硒元素含量分析[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(14): 245-248.

[9] 王化遠(yuǎn), 何俊, 超呈裕, 等. 雞樅菌菌絲體中多糖含量提取及測(cè)定[J].華西醫(yī)大學(xué)報(bào), 1996, 27(4): 436-437.

[10] 施渺筱, 包興起, 李祝. 白蟻與雞縱菌關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)技服務(wù), 2011, 28(8): 1211-1212.

[11] ROULAND-LEFEVRE C, DIOUF M N, BRAUMAN A, et al. Phylogenetic relationships in Termitomyces (Family Agaricaceae) based on the nucleotide sequence of ITS: a first approach to elucidate the evolutionary history of the symbiosis between fungus-growing termites and their fungi[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2002, 22(3): 423-429.

[12] FR?SLEV T G, AANEN D K, LAESS?E T, et al. Phylogenetic relationships of Termitomyces and related taxa[J]. Mycological Research, 2003, 107: 1277-1286.

[13] 付子艷, 李榮春. 云南雞樅菌屬系統(tǒng)關(guān)系的初步研究[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào),2009, 38(3): 271-274.

[14] 卯曉嵐. 中國(guó)大型真菌[M]. 鄭州: 河南科學(xué)技術(shù)出版社, 2000.

[15] 孔祥林, 駱榮, 劉鮮林, 等. 貴陽(yáng)腐霉(Pythium guiyanense Su)菌絲體及無(wú)性繁殖階段的掃描電鏡形態(tài)學(xué)觀察[J]. 電子顯微學(xué)報(bào), 2008, 27(4): 332-335.

[16] 潘欣, 鄒立扣, 彭培好, 等. 杜鵑褐斑病病原菌的分離與鑒定[J]. 北方園藝, 2008(6): 198-200.

[17] MONDAL S, CHAKRABORTY I, PRAMANIK M, et al. Structural studies of water-soluble polysaccharides of an edible mushroom, Termitomyce eurhizus: a reinvestigation[J]. Carbohydrate Research, 2004, 339: 1135-1140.

[18] MONDAL S, CHANDRA K, MAITI D, et al. Chemical analysis of a new fucoglucan isolated from an edible mushroom Termitomyces robustus[J]. Carbohydrate Research, 2008, 343: 1062-1070.

[19] MONDAL S, CHAKRABORTY I, ROUT D, et al. Isolation and structural elucidation of a water-soluble polysaccharide (PS-I) of a wild edible mushroom Termitomyces striatus[J]. Carbohydrate Research, 2006, 341(7): 878-886.

[20] CHAKRABORTY I, MONDAL S, ROUT D, et al. A water-insoluble (1→3)-β-D-glucan from the alkaline extract of an edible mushroom Termitomyces eurhizus[J]. Carbohydrate Research, 2006, 341(18): 2990-2993.

Cloning, Sequencing and Phylogenetic Relationships of ITS Region of rDNA from Termitomyces

LONG Mei1,2, GUO Fang1, GUO Li-juan1,2, HE Xue-mei1,2, LIU Xiao-yan1, LI Bei1, LUO Yan1, ZOU Li-kou1,2,*
(1. College of Resources and Environment, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China; 2. Laboratory of Microbiology, Laboratory of Forestry Resource Conservatio n and Utilization, Dujiangyan Campus of Sichuan Agricultural University, Dujiangyan 611830, China)

The fruit bodies of Termitomyces were collected, and total DNA was extracted as the tem plate to amplify internal transcribed spacer (ITS). Subsequently, the PCR products were sequenced, and the phylogenetic tree of Termitomyces was established based on different parts of ITS region by the MEGA5 software. The results showed that the rDNA-ITS region of 10 different species of Termitomyces was between 527 bp and 661 bp in length. The phylogenetic tree showed that there were eight branches of Termitomyces. T. clypeatus and T. globules were gathered together. The unknown species A1, E1 and H1 which were in a single branch may be new species. B1, G1, and D1 could be identified as T. heimii. In addition, I1 could be T. eurrhizus, and ZZ1 could be T. robustus. However, C1 could not be determined based on the present study. The results showed that the region of ITS1 and ITS1-5.8S rDNA-ITS2 could be used to build the phylogenetic tree for interspecific Termitomyces. The phylogenetic tree of ITS1 had a significantly higher supporting rate, and the ITS2 could be helpful for the confirmation of some unknown species. Therefore, this work has laid a foundation for the classification system of Termitomyces and provided ITS region sequence information for the identification at the molecular level.

Termitomyces; phylogenetic tree; ITS region

TS255.1

A

1002-6630（2014）17-0186-06

10.7506/spkx1002-6630-201417036

2013-04-19

龍梅（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锓肿由飳W(xué)。E-mail：longzm1110@163.com

*通信作者：鄒立扣（1979—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锓肿由飳W(xué)、細(xì)菌耐藥性。E-mail：zoulk124@163.com