劉俊專(zhuān)，王 燕，廖新俤，吳銀寶，胖 是

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510642）

隨著全球溫室效應(yīng)的日益加劇，溫室氣體研究備受各國(guó)學(xué)者關(guān)注。甲烷（CH4）作為重要的溫室氣體之一，其增暖潛勢(shì)約是二氧化碳（CO2）的23 倍，對(duì)全球變暖的貢獻(xiàn)率為19%，僅次于CO2（55%），且甲烷排放每年正以0.9%的速度持續(xù)增加［1］。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)是CH4的重要排放源，40%的CH4排放源于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)［2］。其中畜禽糞便是最為重要的排放源之一，全球約有9%的生物性CH4源于畜禽糞便的管理和應(yīng)用過(guò)程中［3－5］。因此研究畜禽糞便管理利用過(guò)程中甲烷排放對(duì)全球甲烷減排，減輕全球溫室效應(yīng)具有重要意義。

堆肥是實(shí)現(xiàn)畜禽糞便無(wú)害化、減量化和資源化的主要途徑，同樣也是減少畜禽糞便溫室氣體排放的重要方式［6－7］。在堆肥過(guò)程中甲烷排放約占初始總有機(jī)碳的0.01%～8.0%［4］。翻堆可以促進(jìn)堆體升溫、物料降解及腐熟，但也可能影響CH4 排放。近年研究表明，翻堆可顯著減少CH4的排放［8－9］；而也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，翻堆會(huì)增加CH4的排放［6，10］。這可能是因?yàn)椴煌芯坎捎玫姆杨l率不同，從而導(dǎo)致翻堆對(duì)CH4排放產(chǎn)生不同影響。但目前鮮見(jiàn)專(zhuān)門(mén)研究翻堆對(duì)CH4排放影響的相關(guān)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過(guò)設(shè)定不同的翻堆頻率，研究其對(duì)CH4排放所產(chǎn)生的影響，并對(duì)影響CH4生成的微生物菌群進(jìn)行分析，為堆肥過(guò)程中合理翻堆及CH4減排提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 堆肥原料與試驗(yàn)分組

新鮮的蛋雞糞便采自中山市白石雞場(chǎng)產(chǎn)蛋雞舍，傳輸帶收集糞便、打包，第2天運(yùn)輸至試驗(yàn)現(xiàn)場(chǎng)。鋸末購(gòu)自河源市東源縣某木材加工廠。堆肥原料主要成分見(jiàn)表1。將雞糞和鋸末按鮮重濕重比為7.64︰1，控制堆體物料初始重約150kg，初始C／N 為10左右，含水率68%。

按照4 次／d、2 次／d、1 次／d、1 次／3d、1 次／6d和不翻堆6個(gè)不同翻堆頻率，分為A、B、C、D、E 和F（對(duì)照組）6個(gè)處理。A 組每天09︰00、15︰00、21︰00和03︰00翻堆，B 組每天09︰00和21︰00翻堆，其他各組在翻堆當(dāng)天的09︰00翻堆。試驗(yàn)時(shí)間為40d。

1.2 堆肥設(shè)備

采用自行設(shè)計(jì)的動(dòng)態(tài)箱式堆肥試驗(yàn)裝置，內(nèi)部配有攪拌裝置以及溫度探頭，對(duì)堆肥過(guò)程中的溫度實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。堆肥箱長(zhǎng)×寬×高為60cm×60cm×80cm，體積為288L。箱體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

表1 堆肥原料的主要成分Table 1 Main component of composting material

圖1 動(dòng)態(tài)箱式堆肥試驗(yàn)裝置結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure diagram of dynamic box composting test device

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 氣樣采集及CH4濃度測(cè)定 堆肥前15d，每天分別在09︰00～10︰00、14︰00～15︰00和20︰00～21︰00 3個(gè)時(shí)間段，收集1h內(nèi)由箱體出氣口排出的所有氣體，混勻后用1L 鋁箔袋采集氣樣，用于測(cè)定CH4濃度。

采用安捷倫氣相色譜儀（7890A）FID 檢測(cè)器測(cè)定CH4濃度，色譜柱采用Agilent19091P－Q04。CH4排放量的計(jì)算公式如下：

F＝（C1－C2）V

式中：F 為CH4排放量（mL），C1為出氣口CH4濃度（μL／L），C2為進(jìn)氣口CH4濃度（μL／L），V 為出氣口總流量（m2）。

1.3.2 總DNA 提取 堆肥樣品微生物總DNA 采用OMEGA 公司E.Z.N.A.TM Soil DNA Kit試劑盒提取。

1.3.3 產(chǎn)甲烷菌普通PCR 擴(kuò)增 以總DNA 為模板，采用巢式PCR 法進(jìn)行擴(kuò)增，試驗(yàn)所用引物均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。首先采用Met86F和Met1340R 為引物（表2）［11］，擴(kuò)增產(chǎn)甲烷菌16SrRNA 基因片段，目的片段大小為1 254bp，反應(yīng)體系采用25μL 的擴(kuò)增體系，其中Premix Ex TaqTM Version2.0 12.5 μL，引物Met86F（10 pmol／μL）0.5μL，引物Met1340R（1 0pmol／μL）0.5μL，DNA 模板0.5μL，加無(wú)菌ddH2O 至體積25μL。PCR 條件為95 ℃預(yù)變性3min，95 ℃變性30s，54℃復(fù)性30s，72℃延伸80s。34個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10min，然后4 ℃保溫，反應(yīng)結(jié)束后取5μL PCR 產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠于130V 電泳23 min，然后通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察PCR 產(chǎn)物，并拍照記錄，確認(rèn)PCR 擴(kuò)增出目的產(chǎn)物后用于下一步PCR 的模板；再采用產(chǎn)甲烷菌的特異性引物對(duì)GC－Arc344F 和519R（表2）［12］，擴(kuò)增產(chǎn)甲烷菌16S rRNA 基因上的V3可變區(qū)，用于DGGE 分析。反應(yīng)體系采用50μL 的擴(kuò)增體系，其中Premix Ex TaqTM Version2.0 25.0μL，引物GC－Arc344F（10 pmol／μL）1.0μL，引物Arc519R（10pmol／μL）1.0 μL，DNA 模板1.0μL，加無(wú)菌ddH2O 補(bǔ)充體積到50μL。PCR條件為95℃預(yù)變性3min，95℃變性15 s，56℃復(fù)性30s，72℃延伸30s。34個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min，然后4℃保溫，反應(yīng)結(jié)束后取5μL PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠于130V 電泳23min，然后通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察PCR產(chǎn)物，并拍照記錄。

表2 產(chǎn)甲烷菌的引物序列Table 2 Primer sequence of methanogens

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將已知濃度的產(chǎn)甲烷菌質(zhì)粒DNA 用雙蒸滅菌水按1∶10 倍稀釋8個(gè)梯度，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)，同時(shí)作3個(gè)陰性對(duì)照，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)。采用引物GC－Arc344F 和519R（表2）［12］，采用20μL反應(yīng)體系，其中10pmol／μL的引物各0.5μL，2×SYBR Green qPCR Supermix 10μL，超純水8μL。95 ℃預(yù)變性1min，變性15s，52℃退火30s，72℃延伸25s，循環(huán)40次。反應(yīng)結(jié)束后，由溶解曲線判定PCR反應(yīng)的特異性，根據(jù)熒光曲線的Ct值以及標(biāo)準(zhǔn)曲線技術(shù)定量結(jié)果［13］。

堆肥樣品中產(chǎn)甲烷菌拷貝數(shù)計(jì)算公式如下：

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用鄧肯極差檢驗(yàn)法，顯著水平P值設(shè)為0.05。

圖2 各處理甲烷排放總量Fig.2 Total methane emission of different treatment

2 結(jié)果與分析

2.1 CH4 排放總量

由圖2可見(jiàn)，翻堆頻率為4次／d（處理A）、2次／d（處理B）、1次／d（處理C）、1次／3d（處理D）、1次／6d（處理E）和不翻堆（處理F）時(shí)，甲烷排放總量分別為28.60L、50.07L、70.85L、76.48L、90.74 L和59.33L。本試驗(yàn)中，甲烷排放量最高的翻堆頻率為1 次／6d（E 組），最低的翻堆頻率為4 次／d（A 組）。與不翻堆相比，在高翻堆頻率下（4 次／d和2次／d），甲烷的排放量減少，且隨翻堆頻率的增加而甲烷排放量降低。

圖3 甲烷排放量隨堆肥時(shí)間的變化Fig.3 Methane emissions in different composting time

2.2 CH4 排放量隨堆肥時(shí)間變化

如圖3所示，各處理在堆肥初期甲烷排放量最大，這與很多學(xué)者的研究結(jié)果一致［6－7，14－15］。隨堆肥時(shí)間的延長(zhǎng)，甲烷排放量基本呈逐漸下降的趨勢(shì)，但B、C組在9至11d出現(xiàn)一個(gè)甲烷排放小高峰，可能與B、C組此時(shí)溫度上升較快有關(guān)。

堆肥前12d，各組甲烷排放量大小順序?yàn)锳＜B＜D＜E＜F＜C，方差分析表明：堆肥前12d各組甲烷排放量差異不顯著（P＞0.05）。但從堆肥第13 d至結(jié)束各組甲烷排放量大小順序?yàn)锳＜B＜F＜C＜D＜E，A 組顯著低于C、D、E 組（P＜0.05），B 組顯著低于D、E組（P＜0.05），F(xiàn)組顯著低于D、E 組（P＜0.05），C 組顯著低于D、E 組（P＜0.05）。上述分析表明，翻堆對(duì)堆肥升溫期甲烷的排放沒(méi)有顯著影響，但在堆肥高溫期和降溫期，高頻翻堆會(huì)顯著降低甲烷的排放，翻堆頻率越低甲烷排放量越大。

圖4 翻堆后和翻堆前1h甲烷排放強(qiáng)度對(duì)比Fig.4 Comparison of methane emission before and after turning within 1hduring composting

2.3 翻堆前后CH4 排放強(qiáng)度差異

圖4是不同天數(shù)翻堆前后1h內(nèi)收集的氣體中甲烷濃度的比較。由圖4知，各處理翻堆后甲烷濃度均高于翻堆前，且翻堆頻率較低（1 次／3d 和1次／6d）時(shí)，翻堆前后濃度差別最大。說(shuō)明翻堆會(huì)促進(jìn)甲烷的揮發(fā)，翻堆后甲烷排放強(qiáng)度會(huì)增大，在翻堆頻率較低時(shí)，翻堆后甲烷排放強(qiáng)度增加越多。

2.4 產(chǎn)甲烷菌多樣性

堆肥過(guò)程中各組產(chǎn)甲烷菌多樣性指數(shù)H′的變化見(jiàn)表3。由表3可知，各組產(chǎn)甲烷菌多樣性指數(shù)H′的變化趨勢(shì)基本一致，在堆肥開(kāi)始時(shí)各組產(chǎn)甲烷菌多樣性指數(shù)H′為2.38～2.67之間，在堆肥中期由于堆體溫度較高，產(chǎn)甲烷菌活性受到抑制，各組產(chǎn)甲烷菌多樣性指數(shù)H′明顯下降，到堆肥后期，由于堆體溫度的下降，各組產(chǎn)甲烷菌多樣性指數(shù)H′又開(kāi)始升高。

在整個(gè)堆肥過(guò)程中，各組產(chǎn)甲烷菌多樣性指數(shù)H′大小順序?yàn)镃＜A＜B＜D＜F＜E。方差分析表明：各組產(chǎn)甲烷菌多樣性指數(shù)H′差異顯著（P＜0.05）；E組顯著高于A、B、C、D 組（P＜0.05），F(xiàn) 組顯著高于A、B、C組（P＜0.05），其它各組之間差異均不顯著（P＞0.05）。上述分析表明，高翻堆頻率會(huì)降低產(chǎn)甲烷菌的多樣性，這也可能是高翻堆頻率降低甲烷排放總量的主要原因。

表3 各組產(chǎn)甲烷菌多樣性指數(shù)H′的變化Table 3 Changes of methanogens diversity index H′

2.5 產(chǎn)甲烷菌總量

各組產(chǎn)甲烷菌拷貝數(shù)介于1.77×104～7.02×107copies／g DM 之間（表6）。且各組產(chǎn)甲烷菌拷貝數(shù)隨堆肥時(shí)間的變化規(guī)律基本一致，均表現(xiàn)為堆肥初始產(chǎn)甲烷菌含量最高，然后快速下降，在堆肥的6～12d 后，開(kāi)始緩慢上升。這可能是因?yàn)槎逊食跏?，堆體內(nèi)的產(chǎn)甲烷菌尚未適應(yīng)堆體環(huán)境，產(chǎn)甲烷菌數(shù)量迅速下降，當(dāng)適應(yīng)之后，又受堆體溫度的升高及堆體可利用碳源和氮源的限制，而緩慢增加。整個(gè)堆肥過(guò)程中，各組產(chǎn)甲烷菌拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值A(chǔ) 組＜B組＜F組＜C 組＜D 組＜E 組，方差分析表明：差異顯著（P＜0.05）。A 組顯著低于其他各組（P＜0.05），B組顯著低于C、D、E 組（P＜0.05），F(xiàn) 組顯著低于E組（P＜0.05），其他各組差異不顯著（P＞0.05）。說(shuō)明在高翻堆頻率下，翻堆可顯著降低產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量；而在低翻堆頻率下，翻堆會(huì)增加產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量。這與高翻堆頻率會(huì)減少CH4的排放，而低翻堆頻率會(huì)增加CH4的排放的結(jié)果相一致。

表4 各組產(chǎn)甲烷菌總量Table 4 Total methanogens among different treatment copies／g DM

3 討論

本研究中，與不翻堆相比，高翻堆頻率能減少甲烷的排放量，且隨翻堆頻率的增加而甲烷排放量降低，低翻堆頻率增加了甲烷的排放。這可能有以下兩個(gè)原因：（1）在高翻堆頻率下，堆體內(nèi)氧氣濃度上升較快，堆體內(nèi)大部分區(qū)域氧氣濃度較高，抑制了甲烷的生成［5－7］。低翻堆頻率下堆體氧氣濃度較低，堆體大部分區(qū)域處于厭氧狀態(tài)，適合產(chǎn)甲烷菌活動(dòng)產(chǎn)生甲烷，而翻堆促進(jìn)了甲烷的揮發(fā)，同時(shí)堆體內(nèi)的甲烷能被甲烷氧化細(xì)菌氧化，而翻堆促進(jìn)了甲烷的揮發(fā)，使被氧化的甲烷減少，從而促進(jìn)甲烷的排放［4］。（2）通過(guò)影響產(chǎn)甲烷菌多樣性及總量來(lái)影響甲烷排放。熒光定量PCR 研究表明，產(chǎn)甲烷菌數(shù)量的研究表明高翻堆頻率可顯著降低產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量；而低翻堆頻率會(huì)增加產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量。這與高翻堆頻率會(huì)減少CH4的排放，而低翻堆頻率會(huì)增加CH4的排放的結(jié)果相一致?？赡苁且?yàn)榉杨l率越高，前期堆體溫越快，越有利于堆體物料降解，且翻堆頻率越高高溫持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)。而高溫期持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)產(chǎn)甲烷菌活性的抑制作用也越強(qiáng)，導(dǎo)致高翻堆頻率顯著降低產(chǎn)甲烷菌的多樣性指數(shù)和產(chǎn)甲烷菌的總量，從而降低了甲烷的排放。同時(shí)高翻堆頻率還促進(jìn)了蛋雞糞堆肥含水率的降低，而高含水率會(huì)降低堆體的通氣性能，降低了堆體的煙囪效應(yīng)，進(jìn)一步導(dǎo)致了堆體內(nèi)部氧氣缺乏，從而導(dǎo)致低翻堆頻率甲烷排放增加。

不同天數(shù)翻堆前后1h內(nèi)收集的氣體中，各處理翻堆后甲烷濃度均高于翻堆前，且翻堆頻率較低（1次／3d和1次／6d）時(shí)，翻堆前后濃度差別最大。說(shuō)明翻堆會(huì)促進(jìn)甲烷的揮發(fā)，翻堆后甲烷排放強(qiáng)度會(huì)增大，在翻堆頻率較低時(shí)，翻堆后甲烷排放強(qiáng)度增加越多。這主要是因?yàn)榉汛龠M(jìn)了堆體內(nèi)部氣體的交換，使堆體內(nèi)的甲烷大量揮發(fā)，導(dǎo)致翻堆后甲烷排放強(qiáng)度的短暫增大，而低翻堆頻率時(shí)，堆體處于厭氧狀態(tài)區(qū)域更大，堆體內(nèi)蓄積的甲烷更多，因此翻堆后排放強(qiáng)度大幅增加。

4 結(jié)論

在蛋雞糞和鋸末堆肥過(guò)程中，堆肥初期CH4排放量最大，翻堆對(duì)堆肥升溫期CH4的排放沒(méi)有顯著影響，但在堆肥高溫期和降溫期，與不翻堆相比，高翻堆頻率（4次／d和2次／d）會(huì)減少CH4的排放，而低翻堆頻率（1次／3d和1次／6d）會(huì)增加CH4的排放。同時(shí)，高翻堆頻率會(huì)顯著降低產(chǎn)甲烷菌的多樣性指數(shù)和產(chǎn)甲烷菌的總量，而低翻堆頻率顯著增加了產(chǎn)甲烷菌的總量，這可能是導(dǎo)致在不同翻堆頻率下，CH4排放量變化的重要原因。

綜合不同時(shí)期翻堆對(duì)CH4排放量、堆肥進(jìn)程以及成本的影響，2次／d可以降低甲烷的排放，為較合適的翻堆頻率。

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