晏磊，郎傳平，王偉東，王彥杰

基于GenBank中16S rRNA分析的產(chǎn)甲烷菌的地域分布特征

晏磊，郎傳平，王偉東，王彥杰

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

通過從GenBank中搜集產(chǎn)甲烷菌，探討產(chǎn)甲烷菌的地域分布特征。目前，收集到的甲烷桿菌綱，甲烷球菌綱和甲烷火菌綱產(chǎn)甲烷菌16S rRNA序列235條，相似性分析后剩余191條。綜合分析產(chǎn)甲烷菌16S rRNA的全長、前段、中段和后段的系統(tǒng)進(jìn)化樹可發(fā)現(xiàn)，全球不同地域來源的產(chǎn)甲烷菌的分布有一定的特征，甲烷球菌綱的產(chǎn)甲烷菌多來源于海洋沉積物，甲烷微菌綱和甲烷桿菌綱的來源比較廣泛，但也有一定的偏好性，沉淀物和動物來源的產(chǎn)甲烷菌具有明顯差別，而同為淡水、油田或是稻田的產(chǎn)甲烷菌的相似性卻較高。基于此推測產(chǎn)甲烷菌的起源可能是多源的，環(huán)境可能作為進(jìn)化壓力在產(chǎn)甲烷菌的長期進(jìn)化過程中扮演重要的角色。

產(chǎn)甲烷菌；16S rRNA序列分析；地域分布；系統(tǒng)發(fā)育

甲烷是一種溫室氣體，更是新的清潔能源。產(chǎn)甲烷菌是甲烷的主要來源，也是一類極端厭氧古細(xì)菌，屬水生古細(xì)菌門（Euryarchaeota）。甲烷細(xì)菌有球形、桿形、螺旋形，八疊球狀等，還有的能連成長鏈狀[1]。產(chǎn)甲烷菌屬于嚴(yán)格厭氧微生物，常和伴生菌生活在一起，菌體大小形態(tài)都十分相似，在一般光學(xué)顯微鏡下不好判明。而且其生長繁殖特別緩慢，故而培養(yǎng)分離比較困難。美國著名微生物學(xué)家Hungate曾在上世紀(jì)50年代培養(yǎng)分離甲烷細(xì)菌并獲得成功[2]。其后世界上很多研究者對甲烷細(xì)菌進(jìn)行了培養(yǎng)分離工作，并對Hungate所建立的分離方法進(jìn)行了改良，使甲烷細(xì)菌相比過去更易于培養(yǎng)分離。產(chǎn)甲烷菌存在于嚴(yán)格厭氧環(huán)境，如人類的消化系統(tǒng)和反芻動物的瘤胃、動物糞便、厭氧污泥和沼氣反應(yīng)器、湖泊或海底沉積物、深部油層和煤層等環(huán)境中均有分布。此外，產(chǎn)甲烷菌還存在于某些極端環(huán)境中[3]，其數(shù)量豐富，種類繁多。根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》（第九版）截至2016年產(chǎn)甲烷菌已經(jīng)發(fā)展為4綱5目[5]，分別為甲烷桿菌綱（Methanobacteria），甲烷球菌綱（Methanococci），甲烷微菌綱（Methanomicrobia），甲烷火菌綱（Methanopyri），尤其是甲烷微菌綱包括產(chǎn)甲烷菌數(shù)目最多。通過對其基因組學(xué)的研究使得對其代謝特點(diǎn)和分類與其地域分布的聯(lián)系被了解。

16S rRNA經(jīng)常被用來作為原核生物系統(tǒng)發(fā)育以及多樣性研究的標(biāo)志性基因，用表型方法鑒定有困難的原核生物，用16S rRNA序列分析能進(jìn)行快速準(zhǔn)確的鑒定[4]。目前為止，中國，日本，印度，德國，中國臺灣，美國，俄羅斯，太平洋，印度洋以及大西洋等世界各處均有發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷菌。因而，通過對GenBank中搜索到的235條產(chǎn)甲烷菌序列的16S rRNA的分析，了解產(chǎn)甲烷菌的地域分布特征，進(jìn)而探尋到產(chǎn)甲烷菌進(jìn)化起源。

1 數(shù)據(jù)來源與分析方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

截止到2016年4月15日在GenBank中搜索得到的235條產(chǎn)甲烷菌16S rRNA序列。搜索的關(guān)鍵詞有 methanogen 16s，archaeon clone biogas 16s，archaeon methane-producing 16s等，盡可能包括所有產(chǎn)甲烷菌的16S rRNA。由于存在許多長短不一的序列，因而在搜索數(shù)據(jù)時對其長度要求為>700 bp，并且對其進(jìn)行甄別，去除非產(chǎn)甲烷菌的16S rRNA序列。

1.2 數(shù)據(jù)整理與分析方法

將得到的所有產(chǎn)甲烷菌16S rRNA序列信息進(jìn)行整理，利用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov） 在線比對工具對比，根據(jù)Stackebrant等認(rèn)為16S rRNA相似性>97%，認(rèn)為屬于同一個種[6]，對于同一地點(diǎn)，同一批次提交的16S rRNA序列，若有兩條序列相似性>97%，則認(rèn)為兩者屬于同一種產(chǎn)甲烷菌，只需保留一條即可[7]。對所有序列進(jìn)行整理，確定其分離源，國家，分類地位等，并且統(tǒng)計不同生境產(chǎn)甲烷菌在各綱中所占比例。在構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹時，由于所取得的序列長短不一，所作出的進(jìn)化樹可靠性不強(qiáng)，所以利用產(chǎn)甲烷菌的 16S rRNA 的前段（800 bp），中段（500 bp），后段（1 000 bp）和全長分別進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（利用MEGA4.0軟件采用N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹）。同時就不同生境，不同分離源，不同特點(diǎn)的產(chǎn)甲烷菌進(jìn)行分析，以尋求地域規(guī)律性。

2 結(jié)果與分析

2.1 原始數(shù)據(jù)整理

對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理后獲得剩余產(chǎn)甲烷菌16S rRNA191條，對其分離源進(jìn)行分類整理，分別為沉積物來源（包括來自海洋，陸地，油田，地下水，紅樹林等各種生境的沉積物），生物反應(yīng)器來源（包括UASB反應(yīng)器，沼氣反應(yīng)器，沼氣發(fā)電場等各種生物反應(yīng)器），動物來源（包括反芻動物的瘤胃，動物糞便，食木昆蟲的消化道等）。這三種分離源的產(chǎn)甲烷菌16S rRNA數(shù)量分別為110，39，42，在各綱中的比例見圖1。產(chǎn)甲烷菌最多的是甲烷微菌綱，其次是甲烷桿菌綱，甲烷火菌綱收集的數(shù)據(jù)較少，結(jié)合分離源分析發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷菌的甲烷微菌綱和甲烷桿菌綱在三種來源中均占有很大比例，說明在自然界這倆綱的產(chǎn)甲烷菌的分布非常廣泛，數(shù)量領(lǐng)先，因此，甲烷微菌綱是目前產(chǎn)甲烷菌中研究最多的種類。而甲烷菌的動物來源中甲烷桿菌綱的數(shù)目高于甲烷微菌綱，這也許和動物體內(nèi)特殊的微環(huán)境有關(guān)。

在收集到的191條產(chǎn)甲烷菌的16S rRNA中，有甲烷桿菌綱57條，甲烷球菌綱14條，甲烷微菌綱119條，甲烷火菌綱1條，上述四綱的分離來源以及具體分布情況如表1。GenBank中現(xiàn)有的產(chǎn)甲烷菌主要分布于中國，德國，日本，印度，美國，中國臺灣，太平洋，印度洋，大西洋等地。各個地區(qū)中大多以甲烷微菌綱的甲烷菌數(shù)目最多，而美國和法國卻以甲烷桿菌綱的產(chǎn)甲烷菌數(shù)量占優(yōu)勢，另外甲烷微菌綱的分布集中于各大海洋。

2.2 產(chǎn)甲烷菌的系統(tǒng)進(jìn)化分析

產(chǎn)甲烷菌的16S rRNA的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖2，由產(chǎn)甲烷菌的前段，中段，后段以及全段所作出的系統(tǒng)進(jìn)化樹雖然細(xì)節(jié)不同，但大體形狀是相似的，分別出現(xiàn)四個分枝，為分類學(xué)上的四綱，從進(jìn)化樹中可以看出從總的分類上來看，分離源相同的大多聚類分區(qū)明顯，但也有少數(shù)是例外的。以TR-Z13，NBRC 103675為代表的微菌綱的產(chǎn)甲烷菌形成一個最大的分支，以A3，F(xiàn)S406-22為代表的甲烷球菌形成一個較小的分支，以8-2，ATM為代表的甲烷桿菌形成另一個分支，這些都與實(shí)際觀察相符合。

2.3 不同分離源的產(chǎn)甲烷菌的比較

2.3.1 沉積物來源與動物來源的產(chǎn)甲烷細(xì)菌的比較

沉積物與動物來源的產(chǎn)甲烷細(xì)菌比較（見圖1），由圖可知沉積物來源中甲烷微菌綱（66.4%）占優(yōu)勢，而在動物來源中以甲烷桿菌綱（61.9%）為主，另外還發(fā)現(xiàn)球菌綱大多數(shù)只來源于沉淀物。圖3是動物來源和沉淀物來源的產(chǎn)甲烷菌的16S rRNA的單獨(dú)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹，對此觀察分析得到，沉淀物來源與動物來源的產(chǎn)甲烷菌的相似性較低，系統(tǒng)進(jìn)化位置差別明顯。動物來源的產(chǎn)甲烷菌的16S rRNA，相似性較高（90%以上），而沉淀物來源的產(chǎn)甲烷菌的16S rRNA的相似性較低（最高為97%，最低為72%）。

圖1 產(chǎn)甲烷菌16S rRNA各綱的來源比例Fig.1 The classification proportion of source with 16S rRNA for Methanogenic bacteria

表1 產(chǎn)甲烷菌數(shù)據(jù)統(tǒng)計（據(jù)提交GenBank的16S rRNA序列數(shù)統(tǒng)計）Table 1 Methanogenic Bacteria statistics（according to the 16S rRNA submitted to the GenBank）

2.3.2 不同的沉淀物來源的產(chǎn)甲烷菌的比較

圖2 產(chǎn)甲烷菌16S rRNA的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA of Methanogenic bacteria注：圖2中加菱形符號的16S rRNA序列為動物來源

由圖3可知，來自淡水沉積物和海水沉淀物的產(chǎn)甲烷菌各自聚類分區(qū)較為明顯，來自淡水的產(chǎn)甲烷菌屬于甲烷微菌綱居多，且球菌綱數(shù)目稀少，目前未發(fā)現(xiàn)來源于淡水沉淀物甲烷微菌綱的產(chǎn)甲烷菌；來自海水沉淀物的甲烷菌在各綱都有分布，種類豐富，相似性相差較大（最高達(dá)99%，最低只有79%），來自淡水和海水的甲烷微菌綱的相似性較高。對于沉淀物中其他來源，如全球各地的水稻田中發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)甲烷菌的16S rRNA進(jìn)行兩兩比對，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷菌兩兩相似性較高（平均85%以上），另外又對沉淀物中全球油田來源的產(chǎn)甲烷菌的16S rRNA進(jìn)行了兩兩相似性分析，發(fā)現(xiàn)兩兩相似性也較高（平均88%以上）。

2.3.3 不同的動物來源的產(chǎn)甲烷菌的比較

由圖4可知，反芻動物瘤胃和動物糞便來源的產(chǎn)甲烷菌的聚類分區(qū)不明顯，進(jìn)化樹分叉為甲烷微菌綱和甲烷桿菌綱兩種來源的產(chǎn)甲烷菌在上述兩綱中的分布較為均勻，對產(chǎn)甲烷菌的16SrRNA進(jìn)行兩兩比對，發(fā)現(xiàn)兩種來源的產(chǎn)甲烷菌在同一綱中的兩兩相似性較高（平均85%以上）。

圖3 海洋沉淀物與淡水沉淀物的來源的產(chǎn)甲烷菌的16SrRNA的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16SrDNA of Methanogenic bacteria in marine sediments and freshwater sediments注：圖3中圓形圖標(biāo)的是淡水沉淀物來源的產(chǎn)甲烷菌16S rRNA序列

圖4 動物糞便和反芻動物瘤胃來源的產(chǎn)甲烷菌的16SrRNA的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16SrDNA of Methanogenic bacteria in animal manure and rumen in ruminants注：圖4帶有方形標(biāo)記的是動物糞便來源的產(chǎn)甲烷菌的16S rRNA序列

3 討論

對于不同區(qū)域來源的產(chǎn)甲烷菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)相似性高的產(chǎn)甲烷菌多來源于相近的環(huán)境中。如已獲得純培養(yǎng)的2株產(chǎn)甲烷菌MT（AY260432.1）和 SMA-21（NR 109423.1），兩者的相似性大于97%[7-8]，他們分別發(fā)現(xiàn)于德國寒冷的陸地和西伯利亞勒拿河三角洲的活性凍土。兩株可培養(yǎng)的產(chǎn)甲烷菌的 DMS1（AF120163.1）和 TM（AJ276437.1）的相似性也高于97%[9-10]，分別發(fā)現(xiàn)于荷蘭和坦桑尼亞的淡水湖中。法國腦膿腫病人的膿液中發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)甲烷菌Vande（LN876656.1）與美國動物的糞便中發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)甲烷菌GS（NR 044788.1）的相似性達(dá)97%[11-12]。此外，甲烷球菌綱的產(chǎn)甲烷菌多發(fā)現(xiàn)于海洋，由此表明產(chǎn)甲烷菌的分布可能具有一定的區(qū)域性特征。產(chǎn)甲烷菌可能作為土著菌生活在海洋中，經(jīng)過長期進(jìn)化，形成了特定的形態(tài)。如上文所分析，相似的產(chǎn)甲烷菌多來源于相近的環(huán)境中，這也可能是因?yàn)殚L期演化過程中環(huán)境條件作為重要的進(jìn)化壓力使得處于相似環(huán)境中的產(chǎn)甲烷菌向相同方向進(jìn)化。然而也有不同的情況，如三株產(chǎn)甲烷菌如H-A4（KF952484.1）、PL-15/HP（DQ136171.1）和 Mic6c09（AB546256.1）分別分離于墨西哥高鈉鹽堿土的特斯科湖、美國阿拉斯加的海洋沉積物和日本腐蝕的天然氣管道中[13－16]。究其原因可能是三株菌在單獨(dú)進(jìn)化過程中的趨同進(jìn)化，可能是進(jìn)化偶然，也有可能是環(huán)境中某個環(huán)境因子（如pH）作為進(jìn)化壓力促使產(chǎn)甲烷菌朝同一方向進(jìn)化。研究受目前GenBank的產(chǎn)甲烷菌的16SrRNA的數(shù)目限制，隨著對產(chǎn)甲烷菌的更加深入的研究，將得到更多純培養(yǎng)的菌株，更多更大數(shù)量的產(chǎn)甲烷菌的發(fā)現(xiàn)，必然能使人們獲得更加全面的關(guān)于不同地域分布的產(chǎn)甲烷菌的特征，并為產(chǎn)甲烷菌的生態(tài)意義和應(yīng)用前景做出更多貢獻(xiàn)。

4 結(jié)論

不同區(qū)域產(chǎn)甲烷菌的系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷菌具有明顯的生態(tài)分布特征。沉淀物來源和動物來源的產(chǎn)甲烷菌區(qū)分明顯，淡水和海水來源的產(chǎn)甲烷菌也有明顯差別。而同為沉淀物和動物來源的產(chǎn)甲烷菌的相似性較高，反映生態(tài)環(huán)境和產(chǎn)甲烷菌的分布相關(guān)性密切。這些觀測都暗示在長期演化過程中，環(huán)境條件作為重要的進(jìn)化壓力，促使產(chǎn)甲烷菌向同一方向進(jìn)化（相似的環(huán)境形成相似的產(chǎn)甲烷菌類型）或多方向進(jìn)化（不同環(huán)境形成了不同的產(chǎn)甲烷菌類型），由此說明產(chǎn)甲烷菌的起源可能是多源的。

［1］ 王保玉，劉建民，韓作穎，等．產(chǎn)甲烷菌的分類及研究進(jìn)展［J］．基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2014，33（2）：418-425.

［2］ 李煜珊，李耀明，歐陽志云．產(chǎn)甲烷微生物研究概況［J］．環(huán)境科學(xué)，2014，35（5）：3295-3301.

［3］ 朱晨光，宋任濤．產(chǎn)甲烷古菌［J］．能源作物育種，2009，29（1）：1-5.

［4］ 張之強(qiáng)，孫成權(quán)，程國棟，等．可持續(xù)發(fā)展研究進(jìn)展與趨向［J］．地球科學(xué)進(jìn)展，1999，14（6）：589-595.

［5］ 崔曉光，范圣第，權(quán)春善．沼氣池中產(chǎn)甲烷菌的分離鑒定及其分布的研究［D］．大連：大連理工大學(xué)，2007.

［6］ 張文燕，張圣妲，肖天，等.趨磁細(xì)菌的地域分布特征［J］.環(huán)境科學(xué)，2010，31（2）：450-458.

［7］ 郝鮮俊，洪堅(jiān)平，高文俊．產(chǎn)甲烷菌的研究進(jìn)展［J］．資源環(huán)境，2007，35（1）：111-113.

［8］ 劉藝，鄒冬生．甲烷菌的分離純化和產(chǎn)氣效果研究［J］．生態(tài)學(xué)，2014，S181：10537.

［9］ Brber R D，Zhang L，Harnack M，et al.Ingram-Smith K.S.Complete genome sequence Menthanosaeta concilii，a specialist in aceticlastic methanogensis［J］.Journal of Bacteriology，1993（14）：3668-3669.

［10］ Sundset M，Edwards J.Molecular Diversity of the rumen microbiome of Norwegian Reindeer on Natural Summer Pasture［J］．Microbial Ecology，2008（8）：9414-9417.

［11］ Hasan S H，Talat M，Rai S.Sorption of cadmium and zine from aqueous solution by water hyaeinth［J］.Bioresouree Teehnology，2007，98：918-928.

［12］ Hungate R E．Methods in Mcrobiology［M］.New York：A－cademic Press Inc，1969：117-132.

［13］ Mikucki J A，Liu Y，Delwiche M，et al.Isolation from Deep Marine Sediments That Contain Methane Hydrates，and Description of Methanoculles submarinus sp.Nov［J］.Applied and Environmental Microbiology，2003，69：3311-3316.

［14］ Tabassum R， Rajoka I.Methanogensis of carbohydrates and their fermentation products by syntrophic Methane producing bacteria isolated from freshwater sediments［J］.Biosourse Technology，2007，72（18）：199-205.

［15］ Maria V，Sizova A，Nicolai S，et al.Isolation and Characterization of oligotrophic acidotolerant methanogenic consortia from a Sphagum peat bog［J］.Microbiology Ecology，2003，45：301-315.

［16］ Sun W T，Xiao Q M，Lou C R．Production and emission of methane and it’s influencing factor in soil［J］．Rain Fed Crops，2000，20（5）：44-47.

Geographical Distribution Characteristics of Methanogenic Bacteria Based on the Analytics of 16S rRNA in GenBank

Yan Lei，Lang Chuanping，Wang Weidong，Wang Yanjie
（College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

The geographical distribution characteristics of methanogen were discussed through collecting the methanogen from Gen－Bank，235 sequences of 16S rRNA of methanogenic bacteria were collected，191 sequences were left after the filtering.It could be found that the global distribution of methanogens from different regions had certain characteristics after the full-length，front，middle and rear sections of the phylogenetic tree of the 16S rRNA of the methanogens being analyzed comprehensively.The large majority of the Methanococcus are from the ocean sediments.Although，huge numbers of Methanobacteria and Methanomcrobia were widespread throughout the entire earth but had a certain preference，Methanogens isolated from sediments and animals respectively had significant differences，those strains with similar habitats had higher similarity such as the trains from fresh water，oil and paddy.The type of Methanogen was closely related to the habitat condition.Thus，the origin of methanogenic bacteria might be multiple and the environment play an important role in its long evolutionary process.

methanogen;16S rRNA of sequence analysis;geographical distribution;Phylogeny

Q938

A

1002-2090（2017）05-0059-07

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.05.015

2016-10-21

秸稈發(fā)酵高效產(chǎn)沼氣菌系的構(gòu)建及功能（B2011-13）。

晏磊（1981-），男，副教授，蘭州大學(xué)畢業(yè)，現(xiàn)主要從事微生物方面的教學(xué)與研究工作。