蔣聰利，劉志剛，夏立新#

(1深圳大學(xué)過(guò)敏反應(yīng)與免疫學(xué)研究所，深圳 518060；2深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳 518060)

哮喘是肺部慢性炎性疾病，可引起患者氣道高反應(yīng)、黏液分泌增多和氣流阻塞等[1]。近10余年來(lái)，全世界約有1億哮喘患者，哮喘已成為威脅公眾健康的主要慢性炎性疾病。當(dāng)受到多種環(huán)境過(guò)敏原、運(yùn)動(dòng)、呼吸道病毒感染或某些刺激物影響時(shí)，哮喘可能從最初良性的間歇性發(fā)作發(fā)展為嚴(yán)重哮喘[2]。過(guò)敏性哮喘是哮喘的一種最常見(jiàn)類(lèi)型，主要是由吸入性過(guò)敏原引起的一系列哮喘癥狀，持久的氣道炎性反應(yīng)是過(guò)敏性哮喘的主要病理學(xué)改變。這些改變包括支氣管黏膜腫脹，分泌物增多，氣道內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道平滑肌痙攣等。目前，針對(duì)哮喘的治療方法主要是β-腎上腺素受體激動(dòng)劑、白三烯調(diào)節(jié)劑、吸入糖皮質(zhì)激素，避免過(guò)敏原和刺激物，或進(jìn)行免疫治療，但上述方法周期較長(zhǎng)且療效短暫，至今尚不能抑制哮喘發(fā)生或完全治愈[3]。

哮喘發(fā)生的根本原因尚未闡明，多數(shù)治療手段仍為對(duì)癥治療。研究過(guò)敏性哮喘發(fā)病機(jī)制需涉及組織學(xué)、分子和基因變化及蛋白表達(dá)，而microRNA(miRNA)是基因表達(dá)的重要調(diào)控因子，自10年前在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)后，其在許多人類(lèi)疾病中的作用逐漸凸顯[4]；miRNAs在哮喘病因?qū)W的研究中也逐漸受到重視，其可能為過(guò)敏性哮喘的病理研究和治療方法帶來(lái)根本性改變。

miRNA的生物起源和作用機(jī)制

miRNA是真核生物體內(nèi)具有調(diào)控功能的一類(lèi)非編碼RNA，主要位于基因組的內(nèi)含子、外顯子及基因間隔區(qū)。類(lèi)似于mRNA，miRNA在細(xì)胞核內(nèi)由RNA聚合酶Ⅱ/Ⅲ轉(zhuǎn)錄，最初產(chǎn)物pri-miRNA具有5’端帽子結(jié)構(gòu)和3’端多聚腺苷酸尾巴的獨(dú)特結(jié)構(gòu)。pri-miRNA在核酸酶Drosha和輔助蛋白的共同作用下形成約70 nt的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其突出特征是莖環(huán)結(jié)構(gòu)處具有未完全配對(duì)的堿基，且在3’末端有2個(gè)突出的核苷酸。pri-miRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)被細(xì)胞核運(yùn)輸?shù)鞍譋xportin5識(shí)別，與RNA-GTP結(jié)合后將pri-miRNA運(yùn)送至細(xì)胞質(zhì)。隨后，在RNAseIII、Dicer、雙鏈RNA結(jié)合蛋白TRBP的作用下，pri-miRNA被切割成約為22個(gè)堿基對(duì)的雙鏈miRNA。成熟miRNA中的1條鏈合并至沉默復(fù)合體中，成熟miRNA即可通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控[5-7]。miRNA可能有數(shù)百個(gè)靶基因，1個(gè)靶基因也可能由大量的miRNA調(diào)控，從而形成了復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。miRNA還可通過(guò)表觀遺傳機(jī)制(如DNA甲基化、組蛋白乙?；?或調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子影響整體基因表達(dá)[8]。因此，miRNAs可能是調(diào)控過(guò)敏性炎性反應(yīng)的一類(lèi)最具研究潛力的重要分子。

miRNA在過(guò)敏性哮喘中的功能

輔助T淋巴細(xì)胞極化和輔助T2淋巴細(xì)胞型細(xì)胞因子調(diào)節(jié)

T淋巴細(xì)胞是過(guò)敏性疾病患者參與機(jī)體免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞成分。Muljo等[9]構(gòu)建了缺失RNAs和miRNAs加工酶Dicer的小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Dicer酶缺失后T淋巴細(xì)胞發(fā)育受損，數(shù)量減少且趨向凋亡；輔助T(helper T，Th)細(xì)胞增殖減弱，且偏向于表達(dá)Th1型細(xì)胞因子干擾素-γ。目前，多數(shù)研究主要集中在單個(gè)miRNA對(duì)調(diào)節(jié)Th細(xì)胞分化和激活的影響。在Th細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中，miRNA-181a能夠增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞對(duì)外界抗原的敏感性，若抑制未成熟T淋巴細(xì)胞中miRNA-181a的表達(dá)，可降低抗原敏感性、破壞Th細(xì)胞的選擇性，在miRNA-181a/b缺失的小鼠模型中，一系列T淋巴細(xì)胞受體的信號(hào)強(qiáng)度發(fā)生了改變[10-11]。因?yàn)檫^(guò)敏性哮喘是Th2細(xì)胞相關(guān)炎性疾病，所以Th細(xì)胞極化發(fā)育在過(guò)敏性哮喘發(fā)病機(jī)制的研究中至關(guān)重要。有關(guān)過(guò)敏性哮喘模型的研究發(fā)現(xiàn)，炎性肺組織中肥大細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞內(nèi)的miRNA-21表達(dá)過(guò)量。白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-12 p35 3’UTR是miRNA-21靶序列中的保守序列，也是miRNA-21的作用位點(diǎn)，而IL-12是適應(yīng)性免疫應(yīng)答中Th1細(xì)胞極化的關(guān)鍵分子。另外，miRNA-21缺失的CD4+T淋巴細(xì)胞中干擾素-γ水平上升而IL- 4水平下降，猜測(cè)miRNA-21通過(guò)影響IL-12 p35的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)Th1和Th2之間的平衡[12]。miRNA-126在肺組織發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。在塵螨過(guò)敏性哮喘模型中，miRNA-126在氣道管壁細(xì)胞中依賴(lài)Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)4和髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)表現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì)，通過(guò)miRNA拮抗劑抑制miRNA-126高表達(dá)量后可減輕哮喘癥狀，Th2細(xì)胞因子(如IL-5、IL-13)和黏液分泌量均呈減弱趨勢(shì)[12]。Let-7是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的人類(lèi)miRNA家族成員，包含Let-7a～Let-7k。IL-13mRNA是Let-7的靶序列，在過(guò)敏性哮喘小鼠模型中，當(dāng)使用抗let-7的miRNA拮抗劑作用于let-7a、let-7b、let-7c和let-7d后可減輕支氣管肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)并下調(diào)IL- 4、IL-5、IL-13的水平[13]。Kumar等[14]也發(fā)現(xiàn)，給予過(guò)敏性氣道炎性反應(yīng)小鼠下調(diào)let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7f、let-7g和let-7i，可抑制IL-13分泌，從而減輕過(guò)敏性哮喘各種癥狀。因此，Let-7 miRNA在Th2炎性反應(yīng)中是IL-13的一種主要調(diào)節(jié)途徑。另外，還有一些其他的miRNA也在過(guò)敏性哮喘中發(fā)揮作用，如miRNA-155可調(diào)控調(diào)節(jié)性T(regulatory T，Treg)細(xì)胞和Th17細(xì)胞分化，miRNA-146可選擇性作用于Treg細(xì)胞，從而抑制Th1反應(yīng)等。

miRNA與肥大細(xì)胞

肥大細(xì)胞是IgE相關(guān)過(guò)敏性疾病的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，具有免疫調(diào)節(jié)功能。在接觸過(guò)敏原時(shí)，肥大細(xì)胞可釋放炎性調(diào)節(jié)因子，其在發(fā)育過(guò)程中也受到miRNA調(diào)控。miRNA-221和miRNA-222在肥大細(xì)胞激活后明顯上調(diào)，可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期抑制劑p27(kip1)的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖。miRNA-221和miRNA-222同時(shí)過(guò)表達(dá)會(huì)引起大量肥大細(xì)胞處于G0/G1期，少量處于G2/M期[15]。肥大細(xì)胞中miRNA-221具有肥大細(xì)胞特異性，其上調(diào)易引起脫顆粒增多、遷移減少、黏附性增加，且與細(xì)胞骨架調(diào)控和細(xì)胞因子分泌有一定聯(lián)系[16]。肥大細(xì)胞激活后，上調(diào)的miRNA-146a會(huì)增加肥大細(xì)胞凋亡；miRNA-142-3p過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)FcεRI受體介導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒，miRNA-142-3p有可能作為過(guò)敏性反應(yīng)治療的藥物作用靶點(diǎn)[17]。在肥大細(xì)胞分化期間，miRNA-126通過(guò)作用于肥大細(xì)胞增殖副調(diào)控因子Spred1的基因而抑制肥大細(xì)胞增殖[18]。盡管目前發(fā)現(xiàn)許多miRNA與肥大細(xì)胞的增殖、分化和激活過(guò)程相關(guān)，但關(guān)于miRNA在肥大細(xì)胞中的功能還需進(jìn)一步研究。

平滑肌細(xì)胞和上皮細(xì)胞內(nèi)的miRNA

miRNA也能通過(guò)在支氣管平滑肌細(xì)胞和上皮細(xì)胞中的活動(dòng)影響過(guò)敏性哮喘。平滑肌細(xì)胞是氣道高反應(yīng)中主要的效應(yīng)細(xì)胞，在過(guò)敏性哮喘發(fā)病機(jī)理的研究中至關(guān)重要。miRNA-133a是一種肌肉特異性miRNA，有研究報(bào)道，當(dāng)受到IL-13刺激后，miRNA-133a在人氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)水平下調(diào)，而RhoA激酶表達(dá)增多，RhoA激酶為機(jī)體內(nèi)與平滑肌收縮相關(guān)的酶。miRNA-133a能顯著減弱IL-13所致GTP激酶RhoA的基因表達(dá)，合成miRNA-133a以抑制RhoA激酶基因表達(dá)，從而減輕氣道高反應(yīng)性[19]。當(dāng)過(guò)敏性哮喘患者的氣道平滑肌細(xì)胞受到腫瘤壞死因子-α刺激后，細(xì)胞內(nèi)miRNA-140-3p表達(dá)下調(diào)，而miRNA-140-3p可通過(guò)與CD38 3′-UTR結(jié)合或間接涉及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和核轉(zhuǎn)錄因子Kappa B活性來(lái)調(diào)節(jié)CD38的表達(dá)，而CD38是與鈣離子動(dòng)員和細(xì)胞收縮相關(guān)的平滑肌細(xì)胞中的一種膜蛋白[20]。

最近研究表明，在過(guò)敏性哮喘患者和正常人體內(nèi)有66種miRNA在上皮細(xì)胞中的表達(dá)量不同，通過(guò)整個(gè)分子網(wǎng)絡(luò)分析表明，這些miRNA的目標(biāo)基因序列編碼疾病和炎性反應(yīng)相關(guān)的蛋白，如IL-8、IL-6、環(huán)氧化酶2、腫瘤壞死因子-α和水通道蛋白- 4[21]。Let-7家族miRNA與纖維化相關(guān)，當(dāng)肺上皮細(xì)胞受到塵螨抗原刺激后，會(huì)引起let-7g miRNA 驟減[22]。這些研究表明，增強(qiáng)促炎性通路的活性、改變緊密連接蛋白的表達(dá)或其他所觀察到的哮喘患者上皮細(xì)胞變化，這些病理特征或許部分可歸于潛在miRNA異常表達(dá)。

miRNA在過(guò)敏性哮喘診斷及治療中的應(yīng)用

胞外miRNA作為診斷過(guò)敏性哮喘生物指標(biāo)

miRNA在機(jī)體不同組織、細(xì)胞、發(fā)育階段甚至不同疾病狀況中表達(dá)特性各異，這一點(diǎn)與基因表達(dá)情況類(lèi)似。最近研究表明，在血漿、血清、尿液和唾液等無(wú)細(xì)胞體液中發(fā)現(xiàn)了miRNA的存在[23]。因miRNA比mRNA和蛋白質(zhì)分子更穩(wěn)定，所以有研究者提出是否可以將血清中的miRNA作為檢測(cè)疾病的生物指標(biāo)；胞外miRNA是否能夠進(jìn)入受體細(xì)胞并發(fā)揮作用；miRNA是否能夠用來(lái)進(jìn)行細(xì)胞間交流。自2008年首次報(bào)道了胞外miRNA且指出可通過(guò)血清中miRNA-141水平來(lái)診斷前列腺癌[24]后，大量后續(xù)研究證明，miRNA可以作為癌癥、組織損傷、炎性反應(yīng)，甚至特定精神疾病診斷、預(yù)后和預(yù)測(cè)的生物指標(biāo)。研究表明，血清miRNA也可作為不同過(guò)敏性疾病的生物指標(biāo)，在慢性阻塞性肺疾病患者的血清中發(fā)現(xiàn)，miRNA-20a、miRNA-28-3p、miRNA-34c-5p和miRNA-100顯著下調(diào)而miRNA-7上調(diào)，中度哮喘患者和正常人支氣管肺泡灌洗液中miRNA構(gòu)成明顯不同[21]。哮喘是由大量不同的潛在病理生理學(xué)變化構(gòu)成的復(fù)雜慢性疾病，可依據(jù)不同的臨床特征和生理變化將其分成不同類(lèi)別，特異性胞外miRNA作為生物學(xué)指標(biāo)以區(qū)別哮喘內(nèi)在病理變化的依據(jù)是值得深入研究的方向。

miRNA在過(guò)敏性哮喘治療中的作用

目前，關(guān)于過(guò)敏性疾病的治療旨在減輕癥狀，尚不能抑制哮喘及其他過(guò)敏性疾病的發(fā)生。過(guò)敏性哮喘治療方法主要包括兩種，一是吸入性糖皮質(zhì)激素，但這些抗炎藥物對(duì)于中度和重度過(guò)敏性哮喘患者效果并不明顯，該方法并不能特異性針對(duì)哮喘內(nèi)在機(jī)制且易產(chǎn)生糖皮質(zhì)激素抗性等不良反應(yīng)；二是過(guò)敏原特異性免疫治療，方法有效但周期較長(zhǎng)，且目前過(guò)敏原疫苗成分復(fù)雜，難以標(biāo)準(zhǔn)化[25]。抑制Th2細(xì)胞因子治療復(fù)雜多樣化的哮喘并無(wú)足夠。miRNA是機(jī)體產(chǎn)生的內(nèi)源性小分子，許多組織利用其來(lái)調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)的表達(dá)。作用于特異性miRNA，從而通過(guò)基因表達(dá)調(diào)控治療過(guò)敏性哮喘，這或許為過(guò)敏性哮喘的治療開(kāi)辟一個(gè)新的研究方向。人工合成的短雙鏈siRNA也可以發(fā)揮使基因沉默的作用，當(dāng)人工siRNA導(dǎo)入受體細(xì)胞后，盡管靶基因序列的表達(dá)被抑制，但易造成無(wú)法預(yù)測(cè)的脫靶效應(yīng)，從而引起治療的毒副作用[26]。若將外源性miRNA導(dǎo)入細(xì)胞，同一免疫反應(yīng)通路內(nèi)的若干相關(guān)基因可能都會(huì)受到影響。由于miRNA的設(shè)計(jì)保持了進(jìn)化過(guò)程中的天然性，即使在治療過(guò)程中錯(cuò)誤引入細(xì)胞可能也不會(huì)產(chǎn)生毒副作用。因此，miRNA可作為無(wú)毒副作用的方法來(lái)治療過(guò)敏性炎性疾病[21]。因此，可以將作用于pri-miRNA、pre-miRNA和miRNA等加工過(guò)程的小分子抑制劑作為藥物，通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)來(lái)治療過(guò)敏性哮喘。然而，盡管miRNA本身無(wú)毒，但其運(yùn)輸載體可能會(huì)引起不良反應(yīng)，所以需要研究出更多低毒的miRNA表達(dá)調(diào)節(jié)特異性強(qiáng)的運(yùn)送方法，這些都將為miRNA作為未來(lái)過(guò)敏性哮喘的治療手段奠定基礎(chǔ)。

關(guān)于miRNA用于疾病治療的研究已逐漸增多。首個(gè)miRNA靶向藥物——抗miRNA-122寡聚核苷酸已作為抗丙型肝炎病毒的藥物進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)[27]。有研究指出，選擇性封閉miRNA-126可以抑制哮喘表型，使Th2反應(yīng)、炎性反應(yīng)、氣道高反應(yīng)、嗜酸粒細(xì)胞聚集和黏液分泌均減弱[28]。氣道重塑是過(guò)敏性哮喘中的一大特征，miRNA-155與肺部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和氣道重塑相關(guān)。越來(lái)越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)與過(guò)敏性哮喘疾病發(fā)展有關(guān)，從而使其成為最有潛力的治療手段，且基于miRNA的治療藥物已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)期[29]。現(xiàn)代研究技術(shù)的發(fā)展將會(huì)使得研究者更深入的了解miRNA在基因表達(dá)調(diào)控中的作用和其與哮喘發(fā)病機(jī)制間的相關(guān)性，從而利用miRNA使過(guò)敏性哮喘的治療更加個(gè)性化。

總結(jié)和展望

近幾年，我國(guó)由于污染嚴(yán)重出現(xiàn)較多霧霾天氣，且氣候變暖使花粉季節(jié)延長(zhǎng)等，這些環(huán)境因素的改變都將使過(guò)敏性哮喘患病率和發(fā)病率增加。所以，研究過(guò)敏性哮喘發(fā)病機(jī)制、建立有效治療方法顯得十分必要和重要。miRNA在過(guò)敏性哮喘病理研究中的功能還需進(jìn)一步深入，目前大部分研究集中在單個(gè)miRNA針對(duì)某個(gè)靶mRNA的作用，僅了解病變組織中某些miRNA的變化是不夠的，例如在針對(duì)Th細(xì)胞的反應(yīng)中，大部分miRNA是協(xié)調(diào)發(fā)揮作用的，而某個(gè)關(guān)鍵miRNA又可影響多個(gè)靶mRNA。因此，為了更加全面理解過(guò)敏性疾病和哮喘的發(fā)病機(jī)制，應(yīng)針對(duì)這些發(fā)生變化的miRNA進(jìn)行系統(tǒng)研究，建立分子網(wǎng)絡(luò)。另外，miRNA出現(xiàn)在無(wú)細(xì)胞體液中，且較其他小分子穩(wěn)定，使得其具有作為過(guò)敏性哮喘診斷和預(yù)后的生物指標(biāo)的潛能，通過(guò)miRNA表達(dá)調(diào)控亦可達(dá)到治療疾病的目的。隨著生物信息學(xué)、基礎(chǔ)免疫學(xué)、RNA生物學(xué)、基因組學(xué)、蛋白組學(xué)等不同領(lǐng)域發(fā)展，將會(huì)有助于了解受miRNA調(diào)節(jié)或調(diào)節(jié)miRNA的過(guò)敏性哮喘病理通路，從而使miRNA成為過(guò)敏性疾病治療的新方向。

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