陳 媛，虞立霞，洪 燕△，牛 超，高婧瑋，金 宏，汪雪蘭，汪 海△

（1.軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所，天津300050；2.中山大學中山醫(yī)學院，廣東廣州510080）

在高原環(huán)境中，低氧是主要的刺激因子，中樞神經(jīng)系統(tǒng)是對缺氧最為敏感的系統(tǒng)［1］。目前，有大量研究表明高原環(huán)境對人的認知功能如短時記憶、注意廣度、思維判斷能力等產(chǎn)生明顯影響［2］。急性低氧暴露后海馬、皮質(zhì)和紋狀體神經(jīng)元的凋亡可能導致動物空間記憶能力的下降，對神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷［3］，有研究發(fā)現(xiàn)在模擬海拔4 000 m低氧暴露1 d后大鼠腦中小膠質(zhì)細胞的形態(tài)發(fā)生明顯改變［4］，而關于慢性低氧對學習記憶能力及行為能力的影響報道較少，對其機制的研究尚處于探索階段。本實驗模擬高原海拔5 500 m的環(huán)境，檢測不同低氧時間對小鼠認知能力和活動能力的影響及神經(jīng)元重要結構蛋白tau蛋白磷酸化程度的改變，以期探討低氧導致認知功能改變的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選取成年雄性昆明小鼠45只，32～35 g，由軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所動物中心提供。在普通動物房中適應性飼養(yǎng)一周，剔除體重過輕或過重的小鼠。室溫維持在24～27℃，濕度為50%～65%，自由攝食，自然光照。

1.2 高原低氧模型

將實驗小鼠隨機分成 4組（n＝10）：對照組（Control）、8 h低氧暴露組（8 h）、7 d低氧暴露組（7 d）、28 d低氧暴露組（28 d）。將低氧暴露組動物置于低壓艙內(nèi)，模擬海拔高度為5 500 m（380 mmHg），勻速升至固定高度后保持8 h，期間自由攝食。對照組置于另一動物艙內(nèi)，但不低氧，溫濕度與低氧組基本一致。從第1天開始每隔4 d在上艙前稱體重，記錄體重數(shù)據(jù)。下倉后立即對每組動物進行曠場實驗、避暗實驗和蛋白免疫印跡檢測，避免常氧環(huán)境對其影響。

1.3 蛋白免疫印跡

將小鼠處死后，冰上取腦，分離出海馬、皮層，加入RIPA裂解液，冰上裂解，靜置45 min后于 4℃10 000 r／min離心10 min，取上清，蛋白定量后加入上樣緩沖液煮沸5 min。用聚丙烯酰胺凝膠電泳，在電壓100 V的條件下電泳2 h。電泳結束后將蛋白質(zhì)從聚丙烯酰胺凝膠轉移至PVDF膜（Millipore），電壓80 V，1 h。2%BSA室溫封閉 1 h，加入一抗，4℃過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h，ECL化學發(fā)光液顯色。

實驗中所用一抗兔源抗鼠pS396、pT181、pS262購自Abcam，鼠源抗鼠 tau46、兔源抗鼠 tubulin購自Santacruz，鼠源抗鼠 AT8（pS202／T205）購自 Pierce。辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗或羊源抗兔二抗購自 Sigma公司，ECL（enhanced chemiluminescent）試劑盒從Advansta公司購買。

1.4 避暗實驗

避暗箱（購自中國醫(yī)學科學院藥物研究所，型號：SBA-2小鼠避暗程序自動控制儀）由兩個測試箱組成，分為明室和暗室兩部分。暗室可獨立通電，底部銅柵通36 V、50 Hz交流電。測試時將鼠背對洞口放入明室，小鼠進入暗室則受到電擊，避暗儀自動記錄5 min內(nèi)小鼠進入暗室的次數(shù)，即為錯誤次數(shù)，記錄首次進入暗室的時間，即為避暗潛伏期。避暗箱實驗步驟（1）適應環(huán)境：第1天將各組小鼠從明室放入測試箱中，令其在不通電的情況下自由穿梭，適應環(huán)境5 min，然后取出。第2天向暗室底部銅柵通36 V，50 Hz交流電，再將小鼠背對洞口放入明室，小鼠進入暗室則受到電擊，電擊1次即拿出。（2）測試：第3天在同一時間重復前一天實驗，將暗室通電，小鼠放于明室，數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)自動記錄第1次進入暗室的時間（潛伏期）和5 min內(nèi)受到的電擊次數(shù)（錯誤次數(shù)）。若小鼠5 min未進入暗室，錯誤次數(shù)記為0次，潛伏期記為300 s。

1.5 曠場實驗

曠場箱為100 cmⅹ100 cmⅹ100 cm的黑色箱體，底面有25個方格（20 cmⅹ20 cm），上面敞開，中央?yún)^(qū)域為9個方格。將小鼠置于曠場箱中央?yún)^(qū)域，開始計時，記錄小鼠前肢跨出中央?yún)^(qū)域的時間，記為潛伏期。觀察記錄其橫穿的格子數(shù)和直立次數(shù)，當其身體直立雙臂離開地面1 cm算為一次。5 min后停止實驗，將小鼠拿出，用酒精擦拭曠場箱揮干后，進行下一只小鼠的實驗。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 低氧不同時間小鼠體重變化

實驗前各組小鼠體重無差異，低氧處理的前兩周低氧組小鼠體重增長速度與對照組相比較慢，28 d低氧暴露后接近對照，說明對照組與低氧組之間小鼠的生長發(fā)育未見明顯差異。

Fig.1 Trend of body weight variations of control and hypobaric hypoxia（HH）groups（ˉx±s，n＝10）

2.2 不同低氧時間對小鼠短期記憶力的影響

急性低氧8 h后，小鼠避暗潛伏期有所下降，連續(xù)低氧28 d后顯著降低（P＜0.05），錯誤次數(shù)隨著低氧時間的增加而增多（P＜0.05）。說明急性低氧對小鼠的短期學習記憶能力有損傷，慢性低氧較急性低氧嚴重（表1）。

2.3 不同低氧時間對小鼠行為能力的影響

8 h低氧暴露后穿格數(shù)和直立次數(shù)呈降低趨勢，7 d后略有升高，但均不具有統(tǒng)計學意義。28 d低氧暴露后在中央?yún)^(qū)域的停留時間顯著延長（P＜0.05），穿格數(shù)和直立次數(shù)顯著降低（P＜0.05，表2）。*

Tab.1 Effects of hypoxia on the latency period and number of mistakes in passive avoidance test（ˉx±s，n＝10）

Tab.2 Effect of hypoxia on the exploratory and locomotors activity in open field test（ˉx±s，n＝10）

2.4 不同低氧時間對tau蛋白磷酸化的影響

在海馬組織中，隨著低氧暴露時間的增加tau蛋白Thr181、Ser202／T205和Ser396位點的磷酸化程度有上升趨勢，Thr181、Ser202／T205在 28 d低氧暴露后顯著升高分別為 0.91±0.11、0.53±0.05（P＜0.05）；低氧暴露 8 h、7 d時，Ser262磷酸化程度未發(fā)生明顯改變，而28 d后其磷酸化程度明顯升高到0.86±0.09（P＜0.05），為常氧環(huán)境的 3倍。皮層中的磷酸化Thr181、Ser262含量在低氧暴露7 d后達到最高，分別為 0.45±0.07、0.66±0.08（P＜0.05），28 d后略有下降（P＜0.05）；Ser202／T205位點的磷酸化水平隨著低氧暴露時間增加而升高，在28 d時達到最高為 0.51±0.04（P＜0.05，圖 3）。

Fig.3 Influence of hypoxia on the expression of phosphorylated tau in cortex and hippocampus

3 討論

低壓低氧引起腦損傷及功能障礙目前已得到證實。有研究發(fā)現(xiàn)急性低氧暴露可增加腦血管微循環(huán)障礙［5］，也有研究顯示急性低壓低氧環(huán)境導致的空間記憶下降與腦水腫及氧化應激系統(tǒng)失衡有關［6］。此前的研究主要集中在急性低氧造成的血管損傷，關于亞急性、慢性低氧對神經(jīng)系統(tǒng)影響的相關報道較少，其具體機制也尚未完全明了。本研究通過避暗實驗檢測模擬海拔5 500 m不同低氧暴露對小鼠被動逃避能力的影響，28 d低氧暴露后小鼠的避暗潛伏期與對照組相比明顯縮短，平均錯誤次數(shù)增加，提示慢性間歇性低壓低氧會對其短期記憶能力造成損害。曠場實驗結果顯示，隨著低氧時間增加，小鼠在中央?yún)^(qū)域的活動時間增加，穿格、直立次數(shù)降低，說明28 d低氧暴露后小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)處于抑制狀態(tài)，興奮性降低，導致小鼠的自發(fā)活動能力下降。

tau蛋白作為神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要支撐作用的結構蛋白，參與細胞骨架的形成，與微管結合后協(xié)助微管正確組裝，并維持其穩(wěn)定，當其發(fā)生過度磷酸化將可能形成神經(jīng)纖維纏結（neurofibrillary tangles，NFTs）進而導致神經(jīng)元退行性病變及其功能障礙，影響認知能力［7］。目前已發(fā)現(xiàn)的 tau蛋白絲／蘇氨酸位點有79個，在促進和穩(wěn)定微管結合能力方面作用比較大的有30多個［8］，本研究選取的位點分別位于脯氨酸富含區(qū)、重復序列區(qū)域和羧基端區(qū)域。Western blot結果顯示tau蛋白上多個位點的磷酸化程度隨著低氧時間的延長而加劇，低氧可引起tau蛋白的多 個 絲／蘇 氨 酸 位 點 （Thr181、Ser262、Ser202／Thr205、Ser396）發(fā)生過度磷酸化。在海馬組織中，與常氧環(huán)境相比，Ser262、Thr181、Ser202／Thr205和Ser396位點的磷酸化程度在28 d低氧暴露后均顯著升高，其中Ser262位于tau蛋白分子的重復序列區(qū)域，屬于微管結合區(qū)，過度磷酸化會導致tau蛋白從微管上解離，使微管解聚，減弱tau的微管結合能力［9］。Thr181、Ser202／Thr205是脯氨酸富含區(qū)的重要位點，過度磷酸化后會促進tau寡聚化，從而加劇神經(jīng)退行性形變的進程［10］。Ser396位點位于tau的羧基端，這個位點的磷酸化對其形成神經(jīng)纖維纏結起關鍵作用［11］。與海馬組織中的tau蛋白磷酸化變化趨勢不同的是，皮層組織中的tau蛋白磷酸化程度在低氧7 d達到最高，28 d后略有下降，其原因可能是皮層所在的大腦邊緣區(qū)域是對低氧最敏感的腦區(qū)［12］，低氧刺激能導致其在較短時間發(fā)生分子水平的改變。而海馬是與學習記憶最為相關的結構，慢性低氧對其造成損傷的過程較慢，這也能夠從慢性低氧導致動物認知能力和行為活動能力降低體現(xiàn)出來。說明低壓低氧刺激使海馬和皮層組織中的tau蛋白修飾發(fā)生改變，導致神經(jīng)元產(chǎn)生病理性變化，進而影響小鼠的學習記憶能力。

本研究結果提示tau蛋白過度磷酸化可能是低氧引起小鼠記憶衰退的分子機制之一，并為深入開展相關分子機制研究提供參考。

［1］ Virúes J，Segui D，Buela-Casal G，et al.Possible dissociation between attention and memory impairments related to moderate high altitude［J］.High Alt Med Biol，2002，3（Suppl）：S35.

［2］ Gudmundsson G，Gudbjartsson T.High altitude sickness review［J］.Laeknabladid，2009，95（6）：441-447.

［3］ Maiti P，Singh SB，Mallick B，et al.High altitude memory impairment is due to neuronal apoptosis in hippocampus，cortex and striatum［J］.J Chem Neuroanat，2008，36（3-4）：227-238.

［4］ 楊 忠，楊金海，黃慶愿，等，模擬高原低氧對大鼠腦內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)細胞的影響［J］.中國應用生理學雜志.2006，22（4）：393-396.

［5］ 周其全，李 華，沈建雄，等.小鼠急性低氧暴露時腦微循環(huán)障礙研究［J］.中國應用生理學雜志，1991，7（3）：248-250.

［6］ 史清海，伏建峰，葛 迪，等.急性低壓低氧應激導致大鼠認知功能損傷研究 ［J］.西北國防醫(yī)學雜，2012，33（1）：4-7.

［7］ Kosik KS，Joachim CL，Selkoe DJ.Microtubule-associated protein tau（tau）is a major antigenic component of paired helical filaments in Alzheimer disease［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1986，83（11）：4044-4048.

［8］ 劉 鵬，趙玉芬，李艷梅.Tau蛋白介導阿爾茲海默病的機理及相關藥物［J］.中國科學：化學，2010，40（7）：906-913.

［9］ Wang JZ，Liu F.Microtubule-associated protein tau in development，degeneration and protection of neurons［J］.Prog Neurobiol，2008，85（2）：148-175.

［10］ Spires-Jones TL，Stoothoff WH，de Calignon A，et al.Tau pathophysiology in neurodegeneration：a tangled issue［J］.Trends Neurosci，2009，32（3）：150-159.

［11］ Haase C，Stieler JT，Arendt T，et al.Pseudophosphorylation of tau protein alters its ability for self-aggregation［J］.J Neurochem，2004，88（6）：1509-1520.

［12］ Shukitt-Hale B，Kadar T，Marlowe BE，et al.Morphological alterations in the hippocampus following hypobaric hypoxia［J］.Hum Exp Toxicol，1996，15（4）：312-319.