程宇

[摘要]動物行為是受中樞神經(jīng)系統(tǒng)控制的，因此能很好地反映動物腦部的結(jié)構(gòu)功能。阿爾茨海默?。ˋlzheimersDisesse）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性病，起病隱襲，病程呈慢性進行性，是老年期癡呆癥最常見，也是最平常的一種類型。臨床主要表現(xiàn)為記憶性障礙、認知性功能障礙、人格改變及語言障礙等神經(jīng)精神癥狀，日常生活能力會有減退，并有神經(jīng)精神癥狀和行為障礙嚴重影響社交、職業(yè)與生活功能。因此，通過八臂迷宮、曠場等動物認知行為學實驗能很好地反映AD研究藥物對AD模型動物認知和記憶功能的影響，從而了解AD研究藥物的治療效果。

[關鍵詞]AD；八臂迷宮；曠場；物體識別

隨著人口的老齡化，認知障礙疾病如阿爾茲海默病己成為危害社會人群健康的重大疾病之一。流行病學研究顯示，AD的患病率隨年齡增高而增高，在65歲以上人群中約為5%，而在85歲以上人群中約為20%。我國目前患有AD的患者大約350～450萬，通過大樣本流行病學的相關性調(diào)查發(fā)現(xiàn)我國55歲以上AD的患病率分別為2.59%，65歲以上為4.8%。盡管AD發(fā)病的具體誘發(fā)機制仍不十分明確，但可以知道B淀粉樣蛋白及Tau蛋白異常修飾等在病理過程中起到關鍵作用，被廣泛公認。但是由于國際上對AD病理靶點的研究還不夠深入，目前尚缺乏有效的指導思想和治療藥物，因此，尋找更準確有效的指導思想，治療靶點和相關藥物，成為AD治療研究重中之重。

在利用動物樣品（小白鼠）來進行實驗的阿爾茨海默病的病理病例研究中，主要側(cè)重反映各種記憶能力，例如空間記憶能力的結(jié)論測試，測試方法有八臂通道迷宮實驗，新物體辨別實驗等，目前關于阿爾茨海默病的動物模型實驗活動相關研究還比較少，所以我們現(xiàn)在通過曠場實驗對AD動物模型的自主行為特點進行了分析。

1實驗部分

1.1實驗動物

嚙齒類動物具有價格低廉、侍養(yǎng)簡單、生存率高等特點，并且其與人類的腦部解剖結(jié)構(gòu)和生理特征較為相近和相似，更適于誘導模型測試的大量使用，成為AD最常用的動物測試模型。因此實驗室一般選用實驗鼠等嚙齒類動物。雄性SD大鼠44只，購買于廣東省實驗動物中心，實驗所需體重嚴格控制在250～300g范圍內(nèi)。

1.2八臂迷宮

1.2.1實驗原理

八臂迷宮實驗，是目前國內(nèi)外最為常用，最具有參考價值的評價動物學習記憶能力的模型，是由Olton等人建立。主要作用于檢測臨床藥物在實驗動物體內(nèi)，主要是大腦受損狀態(tài)下，工作記憶行為和參考記憶行為等方面的表現(xiàn)，它是由若干個完全一樣的臂組成的，這些臂從中央向四周圍放射出來，每個臂盡頭有水和食物提供，實驗人員再根據(jù)分析動物取食的策略等各種不同參數(shù)可以反映出樣品動物的對應記憶能力。迷宮操作簡單、可行，現(xiàn)已被廣泛用于學習記憶認知實驗功能評價。

1.2.2實驗步驟

（1）實驗動物來到應首先適應新環(huán)境，適應新環(huán)境7-10天后，定期為其稱量體重，禁止進食1-2天，每次訓練完結(jié)后限制性地提供食料約（15-20g），以使實驗動物的體重一直保持在正常進食對照鼠的80%-85%的范圍。（2）第二天，工作人員在迷宮的每個臂端及中央?yún)^(qū)開始分撒食物顆粒（每只5～6粒）。同時將對應數(shù)量的實驗動物置于迷宮中央（打開通道門）。讓實驗老鼠自由攝食、探究10min。（3）第三天，重復第二天的訓練。目的是為了讓實驗動物在沒有應激條件下反復熟悉環(huán)境。（4）第四天起，對實驗動物進行單個訓練：在每個臂靠近外端食盒處各放一顆食粒，讓動物自由攝食，并記錄數(shù)據(jù)，食粒吃完或10min后將動物取出。（5）第五天，將食物放在食盒內(nèi)，將實驗鼠進行重復訓練，一天2次。（6）第六天以后，隨機選若干個（建議先取4個）臂，每個臂放一顆食粒；各臂門關閉，將實驗動物放在迷宮中；30s后，臂門打開，讓動物在迷宮中自由活動并自行攝取食粒，直到動物吃完所有4個臂的食物。若果10min后，食粒仍未吃完，則實驗終止。

每天需要來回進行兩次訓練，每次其間間隔約1h以上。白鼠進入有食物的臂且攝取了食品為一次正確選擇，反之則為錯誤選擇。連續(xù)訓練5次，錯誤選擇次數(shù)為1次或1次以下，同時WME必須為零的情況下，斷定訓練成功。

1.2.3注意事項

本次試驗在操作的過程中主要注意事項是禁止進食，保持重量為原體重81.00%-86.00%，從實驗的結(jié)果和相關數(shù)據(jù)顯示：實驗組與對照組的動物無明顯差異性，排除因樣品饑餓程度不同與其他非學習因素對實驗結(jié)果造成的影響。迷宮實驗外的一切物品在實驗過程中均始終保持不變，目的是使動物進行對照。

實驗顯示，樣品大鼠在八臂迷宮內(nèi)，對于周圍光照、人或移動物體以及迷宮內(nèi)有食物殘渣及糞便的情況不了解等因素導致害怕，腎上腺素分泌過多對實驗結(jié)果有很大的影響，因此實驗環(huán)境始終需要保持安靜，排除外界因素干擾。以上措施，保證了本次采用八臂迷宮訓練小鼠實驗的確實可信性。

1.3曠場實驗

1.3.1實驗原理

曠場實驗原理是評價在新環(huán)境中實驗動物的自主行為、探究行為與緊張程度的一種測試方法。以實驗動物（白鼠）在新環(huán)境中的某些特殊行為的持續(xù)時間，出現(xiàn)頻率和出現(xiàn)次數(shù)等，反映實驗動物在新環(huán)境中的研究行為，主要觀察實驗動物尿便次數(shù)的反應及其緊張程度。

1.3.2實驗過程

實驗過程，關鍵要求必須是日常參與實驗的實驗人員搬運大鼠，實驗員與設備保持適當距離，實驗員避免被實驗大鼠看到。將動物放入箱內(nèi)底面中心，同時進行攝像和計時。觀察3～5min。取出大鼠后，用紙巾沾取75%乙醇徹底清除迷宮，等待液體揮發(fā)擴散后，再進行下一只大鼠的測試。避免前一實驗結(jié)束后實驗動物的殘留痕跡影響下一實驗的測試結(jié)果。然后更換實驗動物再繼續(xù)該實驗。

根據(jù)計算機軟件設計不同可觀察的參數(shù)不同，如某一肢體越過的格子數(shù)為水平得分，后肢站立次數(shù)為垂直得分，修飾次數(shù)，尿便次數(shù)；運動速度，沿邊運動距離，中央運動距離等。所用的計算機失蹤分析系統(tǒng)與新物體識別相同，曠場底部被分成面積相等的9塊正方形格子。將實驗鼠放置在中央格，曠場上方的攝像機開啟并記錄該動物在一段時間內(nèi)的活動情況，通過軟件分析系統(tǒng)分析實驗鼠在一定時間內(nèi)的活動狀態(tài)，約10min。

主要觀察目標：①其在方格間穿行的次數(shù)②直立次數(shù)③實驗鼠在中央格停留時間④實驗鼠穿過中央格次數(shù)等。

研究認為，實驗鼠經(jīng)過格子的次數(shù)可代表動物的興奮程度；實驗鼠站立的次數(shù)可以代表動物對陌生環(huán)境的好奇心及適應能力。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，P<0.05，被認為是有統(tǒng)計學相對差異。

一般情況下，實驗鼠喜暗，因此其在曠場實驗中經(jīng)常在邊緣區(qū)域活動，但對照鼠沒有目標地在曠場中奔跑，由于其在中央?yún)^(qū)出現(xiàn)的次數(shù)明顯多于正常大鼠，直立次數(shù)、活動總數(shù)以及在中央?yún)^(qū)出現(xiàn)的比率等幾項指標反映大鼠的自主活動，并和AD大鼠病情嚴重程度有相關性。因此在一定程度上可以反映相對人類患者也會表現(xiàn)出煩躁不安，肢體強直等次能夠為發(fā)病特征。實驗證明，曠場實驗能夠檢測動物模型的自主行為變化，可以用做更廣泛的藥物研發(fā)實驗。尤其是隨著現(xiàn)代教育技術發(fā)達，再加上計算機技術和圖像處理技術攝影技術等的引入，使動物行為分析的檢測指標和工具大大增加，顯現(xiàn)出該實驗的高效、無創(chuàng)、靈敏、客觀等優(yōu)點。

2總結(jié)

目前，世界各國包括我國，隨著人口老齡化進程的到來，和年齡相關的認知性功能障礙已經(jīng)成為目前醫(yī)藥行業(yè)神經(jīng)科學研究的熱門話題。為了能使人們更好地了解認知性功能相關疾病的發(fā)病機理，選擇合適的方法很重要，例如動物行為學實驗研究方法（如曠場實驗）對于目前的行業(yè)來說是有必要的。各種動物模型的出現(xiàn)，使得認知功能評估可以為研究AD提供重要的依據(jù)。其局限性為，人類和實驗動物存在種群差異和個體差異，人類的認知功能區(qū)別于動物，是一個高級復雜的腦部神經(jīng)活動過程，而動物的行為學實驗內(nèi)容也有別于人類的認知，人類的許多認知功能是人類獨有的而不能在實驗模型中表現(xiàn)出來的。在實驗過程中，因個體以及種群差異，僅僅通過動物的表現(xiàn)而不參考人類的實際表現(xiàn)是無法精確評估學習和記憶的完整信息的，因為實驗動物可能受認知能力等不相關的因素干擾。而每種行為學實驗方法的使用條件與側(cè)重點都不一樣，應用時要根據(jù)不同樣品的不同需要進行適當選擇。必要時也可結(jié)合多種動物行為學實驗方法來進行不定期綜合統(tǒng)計分析，與影像學、現(xiàn)代教育學，組織病理學，組織藥理學及神經(jīng)電生理技術等結(jié)合，為阿爾茲海默病的研究提供科學可靠的依據(jù)。