孫海龍 綜述 陳秀娟 審校

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心 （呼和浩特 010059）

精子DNA損傷及其檢測

孫海龍 綜述 陳秀娟 審校

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心 （呼和浩特 010059）

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，精液常規(guī)分析已不能全面評估男性生育能力。研究表明，精子DNA損傷是男性不育、復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(RSA)以及輔助生殖技術(shù)治療失敗的重要原因之一[1]。

一、精子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

精子作為一種終末分化細(xì)胞，成熟精子攜帶由基因和環(huán)境共同決定的遺傳信息，直接影響下一代生命的形成與存在狀態(tài)。精子發(fā)育過程中發(fā)生一系列的形態(tài)變化、胞內(nèi)重要結(jié)構(gòu)的重排以及代謝途徑和方式的改變等，這些變化都是精子為適應(yīng)環(huán)境而進(jìn)行的自身調(diào)整。精子細(xì)胞核約占精子頭部的65%，是精子最重要的細(xì)胞器，由DNA和魚精蛋白（protamine，PRM）組成。在精子發(fā)生過程中，生精細(xì)胞核內(nèi)與DNA結(jié)合的蛋白，經(jīng)歷組蛋白到過渡蛋白再到魚精蛋白的組型轉(zhuǎn)換。單倍體圓形精子細(xì)胞剛形成時，染色質(zhì)仍呈核小體結(jié)構(gòu)，過渡蛋白（Transition proteins, TPs）開始出現(xiàn),并逐漸取代染色體中的組蛋白, 直至替換掉90%以上的組蛋白，隨后魚精蛋白開始出現(xiàn)并逐漸取代過渡蛋白,最終將精子核包裝成高度濃縮的特異結(jié)構(gòu)，從而保護(hù)精子免受外界因素?fù)p傷。

二、精子DNA損傷機(jī)制

（一）氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時，體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）和活性氮自由基（reactive nitrogen species，RNS）產(chǎn)生過多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷。

生理情況下，少量ROS存在，是精子發(fā)揮正常功能如獲能、頂體反應(yīng)，以及精卵融合所必須的。精子質(zhì)膜中含有高濃度的不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids, PURA），只含有低濃度的ROS清除酶。精子細(xì)胞內(nèi)的自身抗氧化系統(tǒng)極其有限，且細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶并不能保護(hù)精子頂體和尾部的質(zhì)膜，這就迫使精子必須依靠精漿中的抗氧化系統(tǒng)。精漿抗氧化系統(tǒng)（total antioxidant capacity，TAC），分為兩類，一類為酶抗氧化系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）等；另一類為非酶抗氧化系統(tǒng)，包括維生素、微量元素等[2]。精液中的ROS和精漿抗氧化能力保持平衡，當(dāng)精液中的ROS增加或精漿抗氧化能力減低時，這種平衡被打破，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生[3]。超氧化物可使精子在氧化應(yīng)激的作用下發(fā)生脂類過氧化反應(yīng)，使精子膜的流動性和完整性受損，精子DNA更易暴露于外界環(huán)境中而受到損傷[4]。

（二）凋亡異常

細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡，是指細(xì)胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序結(jié)束生命的過程。凋亡是精子發(fā)生過程中的一個重要環(huán)節(jié)，自發(fā)凋亡對維持正常精子數(shù)量及精子質(zhì)量非常重要[5]。有證據(jù)提示，許多質(zhì)量不好的精液中缺乏精子正常凋亡。生精細(xì)胞凋亡通過Fas/FasL及半胱氨酰天冬氨酸酶（Caspase）途徑介導(dǎo)，該途徑異常可導(dǎo)致DNA損傷的生精細(xì)胞逃脫正常的程序化死亡，不斷增殖分化，導(dǎo)致DNA損傷精子數(shù)量增加[6]。如果一個DNA受損的精子不從機(jī)體中消除，就有可能與卵子結(jié)合、受精，導(dǎo)致流產(chǎn)或胎兒出生缺陷的發(fā)生。

生精細(xì)胞過度凋亡可導(dǎo)致精細(xì)胞減少（精子減少），這可能是導(dǎo)致男性不育的重要原因之一，在自然狀態(tài)下，環(huán)境因素如激素、溫度、化學(xué)藥物、射線以及腫瘤等均可誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡。

（三）精子核成熟過程異常

精子細(xì)胞核成熟過程中需要發(fā)生組蛋白向魚精蛋白（PRM1和PRM2）的轉(zhuǎn)變[7]。組蛋白被魚精蛋白取代過程中常伴隨生理性的DNA雙鏈斷裂，這些斷裂如果不能及時有效修復(fù)便會引發(fā)DNA損傷[8]；魚精蛋白與DNA結(jié)合后，魚精蛋白分子內(nèi)和分子間的巰基逐漸被氧化成二硫鍵，使精子DNA與魚精蛋白結(jié)合更為緊密，精子核更趨濃集和穩(wěn)定[9]。Prm1和Prm2在精子中恒定于0.8～1.2這一嚴(yán)格比例標(biāo)準(zhǔn)[10]，當(dāng)魚精蛋白合成缺陷或功能異常時，必然會導(dǎo)致精子染色質(zhì)濃縮過程的異常，形成松散結(jié)構(gòu)的染色質(zhì)，引起精子DNA損傷。

三、精子DNA損傷原因

（一）微量元素缺乏

微量元素是精液的重要生化成分，對維持精子生存環(huán)境的穩(wěn)定有重要的生物學(xué)意義，微量元素直接參與精子的構(gòu)成，對精子的成熟、運(yùn)動、獲能及頂體反應(yīng)等一系列生理功能產(chǎn)生影響。

鋅（Zine，Zn）是二價的陽離子，能和許多陰離子結(jié)合，而且對電子親和力特別高，所以鋅能與許多基團(tuán)和配體相結(jié)合。與鋅結(jié)合的基團(tuán)或配體所生成的絡(luò)合物比較穩(wěn)定。人體內(nèi)鋅的含量以精子中為最高，其次是前列腺、指甲和骨骼。鋅能夠延緩精子細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化，維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的通透性和穩(wěn)定性[11]，從而使精子保持良好的活力。硒作為體內(nèi)抗氧化劑，參與消除體內(nèi)產(chǎn)生的各種自由基，研究表明精漿中的硒能使人類精子細(xì)胞免受氧化性DNA損傷[12]。此外，精液中的鎘能置換DNA鋅指結(jié)構(gòu)中的鋅離子，導(dǎo)致DNA的修復(fù)受到抑制，同時也能誘導(dǎo)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)上的過氧化導(dǎo)致精子DNA氧化損傷。

（二）生殖系統(tǒng)疾病

生殖道感染和非特異性炎癥增加了精子DNA損傷，可能由于生殖道感染和非特異性炎癥使精液中白細(xì)胞的數(shù)量增加，引起局部氧自由基增加，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，并最終損傷精子DNA[13]。生殖道人乳頭瘤病毒（HPV）感染時HPV DNA可以非特異性、多位點(diǎn)方式整合入人精子染色體中，增加了精子基因的不穩(wěn)定性，誘導(dǎo)精子染色體畸變，其結(jié)果必然造成精子DNA損傷[14]。

精索靜脈曲張（varicocele ,VC）是引起男性不育的重要原因，黃宇烽[15]報道了VC導(dǎo)致不育的細(xì)胞分子機(jī)制，與生精細(xì)胞凋亡異常和睪丸組織、精漿中過量ROS導(dǎo)致精子DNA損傷有關(guān)。Zini等[16]研究顯示，VC患者術(shù)后4個月的精子DNA碎片率較術(shù)前顯著降低。

（三）溫度異常

精子發(fā)生需要適宜的溫度，哺乳動物陰囊溫度一般比腹腔溫度低2～8℃，適于精子的生成。精子的發(fā)生過程對溫度非常敏感。研究發(fā)現(xiàn)，陰囊溫度增高可導(dǎo)致精液質(zhì)量和精子DNA完整性均下降[17]。其原因可能是：作用在睪丸和附睪的熱應(yīng)激導(dǎo)致冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白（cold inducible RNA-binding protein，CIRP）表達(dá)減少，而使生殖細(xì)胞凋亡數(shù)量增多，造成生精能力喪失，也可能是組蛋白與魚精蛋白的比率增加使精子DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致精子DNA損傷。近期研究顯示溫度越高對精子染色質(zhì)的破壞越大[18]。

（四）吸煙

關(guān)于吸煙對精子DNA的影響，國內(nèi)外學(xué)者已進(jìn)行了大量的研究。已有的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，香煙煙霧中含有大量自由基，如H2O2、O2-，它們可使DNA發(fā)生氧化和過氧化損傷，導(dǎo)致DNA鏈斷裂[19]；吸煙還會增加DNA的脆弱性。煙草中的尼古丁及其代謝產(chǎn)物中富含有誘導(dǎo)基因突變和致癌的物質(zhì)，這些物質(zhì)可使精子對酸性誘變劑的敏感性增高，導(dǎo)致精子DNA鏈斷裂增加。

（五）環(huán)境污染物

環(huán)境因素與精子DNA完整性間存在一定關(guān)系。Rubes等[20]究發(fā)現(xiàn)，暴露于污染環(huán)境中的人, 精子DNA損傷率有顯著增高。苯及其同系物甲苯、二甲苯與人們的生活密切相關(guān)，它們被廣泛的應(yīng)用于油漆、噴漆、印刷、橡膠、制鞋、五金機(jī)械及有關(guān)化工合成等許多方面，苯及其同系物作為脂溶性化合物，容易通過血-睪屏障進(jìn)入睪丸。睪丸上皮細(xì)胞富含代謝酶類[21]，在這些酶的作用下，苯可產(chǎn)生ROS，從而誘發(fā)精子DNA氧化性損傷。

（六）射線及化療藥物

人們對電離輻射損傷的認(rèn)識已有幾百年的歷史，電離輻射通過直接和間接效應(yīng)對精子DNA造成損害。直接效應(yīng)是指DNA直接吸收射線能量而遭損傷；間接效應(yīng)是指DNA周圍其他分子吸收射線能量產(chǎn)生具有很高反應(yīng)活性的自由基進(jìn)而損傷DNA[22]。近期有報道無線網(wǎng)絡(luò)（WiFi）對精子的活力和精子染色質(zhì)完整性都有影響[23]。癌癥的化學(xué)療法和放射療法對DNA的損傷更是廣為人知，許多腫瘤治療藥物都是以DNA作為靶點(diǎn), 抗癌藥物的使用會造成精子染色質(zhì)的損傷，并且動物實(shí)驗證實(shí)這些 藥物不僅會引起DNA的斷裂，還會引起精子DNA甲基化等表觀遺傳的變化[24]，因此對于尚未生育的癌癥患者在治療前建議進(jìn)行精子凍存，以備后用。

（七）年齡

精子DNA完整性與年齡因素密切相關(guān)。Wyrobek等[25]，通過對20～80歲人群進(jìn)行精子DNA完整性檢測發(fā)現(xiàn)，年齡是影響精子DNA完整性的重要因素，隨年齡增加，凋亡精子百分率增加，DNA完整精子百分率降低。

（八）輔助生殖技術(shù)

體外精液處理技術(shù)是輔助生殖技術(shù)中的常規(guī)操作，其目的是獲得沒有精漿、細(xì)胞碎片及病原微生物的精子懸液，得到足夠數(shù)量形態(tài)及功能正常的精子。目前臨床上常用的方法有上游法、密度梯度離心法和離心洗滌法。但很少有人知道這些處理技術(shù)對精子DNA完整性的影響。用上游法處理后變性DNA精子的百分?jǐn)?shù)與未處理精液相比明顯減少。與未處理精子相比，用2層和4層Percoll梯度離心處理后平均精子活力在相當(dāng)大程度得到改善，但是變性DNA精子百分?jǐn)?shù)增加。有文獻(xiàn)報道冷凍過程中產(chǎn)生的活性氧，可導(dǎo)致精子DNA損傷[26]，凍存時間對于精子DNA完整性有影響，不添加保護(hù)劑直接凍存和添加保護(hù)劑對精子DNA完整性的影響無顯著差異，只有在經(jīng)過一次上游法處理后染色質(zhì)質(zhì)量才會得到改善。此外，體外處理時間過長、離心步驟過多和離心速度過快，均會造成精子的物理損傷并形成過氧化物或其他殘留物，ROS也會大量增加，造成精子DNA氧化損傷。

近年來，微流控芯片精子分選法已應(yīng)用于臨床，微流控芯片精子分選技術(shù)是利用流體在納米尺寸管中形成層流，以及各層液體之間互不干擾的物理現(xiàn)象來設(shè)計芯片，利用精子活動性的自然特性，精子運(yùn)動速度大于一定值的精子從原液中通過層流面游到另一個液流中，從而實(shí)現(xiàn)對活動精子的分選[27]。王維等[28]研究發(fā)現(xiàn)，微流控芯片法和傳統(tǒng)上游法所優(yōu)選出來的精子相比較，芯片法更能優(yōu)選出低DNA損傷率的精子。

這些研究結(jié)果提示我們要重新看待輔助生殖技術(shù)中精液的處理方法，選擇最佳的組合方式。

四、精子DNA完整性的檢測方法

（一）精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析試驗（SCSA）

SCSA的方法與原理是：染色質(zhì)結(jié)構(gòu)損傷精子的魚精蛋白S-H沒被氧化，形成松散結(jié)構(gòu)的染色質(zhì)，DNA在酸的作用下變性成單鏈。吖啶橙（AO）可與雙鏈DNA結(jié)合呈單體形式發(fā)出綠色熒光，與單鏈DNA結(jié)合呈聚合物形式發(fā)出紅或黃色熒光。然后通過配有專用軟件的流式細(xì)胞儀可進(jìn)行數(shù)據(jù)處理得出SCSA參數(shù)[29]。SCSA的創(chuàng)始人Evenson，對SCSA參數(shù)用于男性生育力的評估和預(yù)測亞臨床不孕進(jìn)行了大量研究，得出評估人生育潛能的閾值：0～15%時具有高生育潛能；16%～29%具有中生育潛能；≥30%具有低生育潛能；80%～90%無生育能力[30]。SCSA是檢測精子DNA損傷中使用較多的一種方法，被認(rèn)為是檢測精子DNA損傷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[31]。

（二）熒光原位雜交技術(shù)（FISH）

FISH是以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法。探針首先與介導(dǎo)分子結(jié)合，雜交后再通過免疫化學(xué)過程連接上熒光染料，在核中或染色體上相應(yīng)的DNA序列上顯示雜交信號。其最大優(yōu)點(diǎn)是可以與間期細(xì)胞核雜交，對一些體外不能分裂的細(xì)胞如人的成熟精子尤為合適。

（三）彗星實(shí)驗

基本原理是：DNA損傷斷裂后，在強(qiáng)堿的條件下，DNA雙鏈被打開，釋放出斷裂的DNA片段，暴露了負(fù)電荷，電泳時，在電場力作用下，從核內(nèi)遷出，向陽極遷移，從而形成“彗星”狀影像。DNA損傷越多，進(jìn)入尾部的DNA碎片越多。結(jié)果的判斷有不同方法，可根據(jù)計數(shù)一定量細(xì)胞中彗星細(xì)胞所占的比例，估計精子DNA損傷比率；還可以在顯微鏡下或在照片上測出彗星細(xì)胞的一些長度數(shù)值，如尾長和彗星細(xì)胞總長、尾長與頭部直徑比值等，評估DNA損傷程度。但用上述指標(biāo)評估精子DNA損傷程度尚不全面。有人用“尾距”來表示精子DNA損傷程度，尾距為尾部DNA占總DNA的百分率與頭、尾部中心間距的乘積。研究發(fā)現(xiàn)，尾距與精子DNA損傷程度可保持較好的線性關(guān)系，故該參數(shù)能較滿意地用于多種情況下的彗星試驗分析。

（四）原位末端標(biāo)記法（In situ end-labeling，ISEL）

ISEL是將摻入到凋亡細(xì)胞中的外源性核苷酸在酶的催化下與細(xì)胞中斷裂的單鏈或雙鏈DNA相結(jié)合，并通過一定的顯示系統(tǒng)使之顯示出來。ISEL有兩種：原位缺口平移法（In situ nick translation，ISNT）和末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP末端標(biāo)記法（terminal deoxynu- cleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling ，TUNEL）。結(jié)果可用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡或光學(xué)顯微鏡檢測。

（五）精子染色質(zhì)擴(kuò)散試驗（sperm chromatin dispersion test，SCD）

SCD是由Fernández等[32]，首先于2003年提出的一種檢測精子DNA損傷的新方法，基本方法和原理是：精子包含魚精蛋白，可作為精子主要的核蛋白與其他細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)志性區(qū)分。運(yùn)用核蛋白溶解液可以在精子細(xì)胞和其他細(xì)胞之間造成不同核蛋白的擴(kuò)散速度。魚精蛋白的擴(kuò)散速度比組蛋白快，可用DNA靶向性染料染色分辨精子細(xì)胞和其他細(xì)胞。精子核蛋白擴(kuò)散還可用來分析包含較多染色質(zhì)斷裂的精子細(xì)胞。沒有大量DNA 斷裂的正常精子細(xì)胞可形成由DNA延伸環(huán)組成的核暈，而有較多DNA斷裂的異常精子細(xì)胞沒有核暈，或者核暈很小。SCD 法正是運(yùn)用核蛋白攜帶DNA擴(kuò)散的原理，對精子DNA斷裂程度進(jìn)行檢測。將精子懸液與瓊脂糖混合鋪于載玻片上，酸處理后溶解細(xì)胞去除核蛋白，用DAPI試劑染色，最后用熒光顯微鏡觀察。由于熒光容易發(fā)生淬滅，暈環(huán)的大小在熒光顯微鏡下不容易區(qū)分，也不容易區(qū)分精子和其他精液細(xì)胞。Fernández等[33]，改進(jìn)了SCD檢測方法，用瑞氏染液染色，可在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。根據(jù)精子DNA產(chǎn)生的光暈進(jìn)行評估，正常的精子DNA產(chǎn)生擴(kuò)散的光暈，而損傷的精子DNA則不產(chǎn)生或產(chǎn)生很小的光暈。

（六）8-羥基脫氧鳥苷（8-Hydroxydesoxyguanosine, 8-OHdG）測定法

8 -羥基脫氧鳥苷（8-OHdG），是精子DNA氧化損傷較理想的分子生物學(xué)標(biāo)記物，是ROS攻擊DNA分子中的鳥嘌呤堿基第8位碳原子而產(chǎn)生的一種氧化性加合物（DNA加合物是親電性化合物及其代謝產(chǎn)物和生物體內(nèi)的DNA形成的共價結(jié)合產(chǎn)物，是DNA化學(xué)損傷的最普遍形式）。ROS能直接與DNA分子反應(yīng),導(dǎo)致DNA鏈斷裂、堿基修飾和DNA蛋白交聯(lián)等氧化性DNA損傷，其中最主要的致突變性損傷反應(yīng)是C-8上鳥嘌呤與胸腺嘧啶堿基顛換性突變，產(chǎn)生8-OHdG。8-OHdG在體內(nèi)穩(wěn)定存在，從精子中提取的DNA在變性后依次用脫氧核糖核酸酶 、核酸酶及堿性磷酸酶消化DNA,然后通過液相色譜電化學(xué)檢測器檢測8-OHdG和脫氧鳥苷（dG）濃度，結(jié)果用OHdG/ 105dG表示，8-OHdG含量與精子DNA氧化損傷程度成正相關(guān)。

（七）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）

目前，PCR主要用來研究精子線粒體DNA完整性。PCR技術(shù)可更精細(xì)地研究精子DNA的完整性是否異常，較為客觀可靠，可進(jìn)行定量或定性研究。但PCR對樣品的保存和放置時間等影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性的變化因素較為敏感。因此。嚴(yán)格控制精子放置的溫度與時間，對流式細(xì)胞精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析是非常重要的。

（八）激光拉曼光譜技術(shù)

精子質(zhì)量評估普遍采用的是DNA核酸染料，雖然具有很高的靈敏性，但其對精子具有破壞性，因此，很難用測定后的樣本進(jìn)行下一步的活體實(shí)驗驗證。近來，Mallidis等[34]，采用拉曼光譜技術(shù)來檢測精子DNA損傷。精子拉曼光譜主要是由糖、脂類、蛋白質(zhì)和核酸等成分疊加而成，精子不同拉曼光譜頻率對應(yīng)地反映出精子內(nèi)部物質(zhì)組分的變化，這有助于從分子生物學(xué)水平進(jìn)一步研究精子DNA空間結(jié)構(gòu)的變化。拉曼光譜具有非侵襲性和無損檢測的特點(diǎn)，因此，不會對活的生物樣本造成損傷，結(jié)合生物信息學(xué)分析方法，有望對其與卵母細(xì)胞受精以后的胚胎發(fā)育做出準(zhǔn)確的判斷和預(yù)測[35]。拉曼光譜作為一種無損傷的生殖細(xì)胞評估技術(shù)，對臨床有重大的研究價值，可望成為精子形態(tài)與功能的新的無創(chuàng)評估技術(shù)。

五、展望

目前，精子DNA完整性在男科學(xué)和生殖醫(yī)學(xué)中的重視程度正在逐步提高，但精子DNA損傷發(fā)生的確切機(jī)制尚不完全清楚，其治療還處于探索階段。雖然目前已有多種精子DNA完整性的檢測方法，但尚缺乏一種快速、簡便、標(biāo)準(zhǔn)化且能夠廣泛普及的檢測方法。隨著對精子DNA完整性研究的逐步完善和發(fā)展，相信在不久的將來，有望研究出一種理想的檢測精子DNA完整性的方法。

精子; DNA損傷

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（2014-05-30收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.09.020

R 321.1