陳建明 童曉潔 陳 瑾

廣州醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510140

丹參酮ⅡA對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖的影響

陳建明 童曉潔 陳 瑾

廣州醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510140

目的 研究丹參酮ⅡA對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖的影響。 方法 將人牙周膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)在含不同濃度的丹參酮ⅡA培養(yǎng)液中（實(shí)驗(yàn)組），同時(shí)設(shè)不含丹參酮ⅡA的空白對(duì)照組，24、48、72 h后，以CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。 結(jié)果 在倒置顯微鏡下，實(shí)驗(yàn)組貼壁人牙周膜成纖維細(xì)胞數(shù)目明顯減少。加藥培養(yǎng)48、72 h，不同濃度丹參酮ⅡA組細(xì)胞的光密度（OD）值明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。 結(jié)論 丹參酮ⅡA對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖有一定的抑制作用。

丹參酮ⅡA；人牙周膜成纖維細(xì)胞；牙周組織；改建

在口腔正畸治療過(guò)程中，要把牙齒重新排列，需要對(duì)牙槽骨不斷進(jìn)行改建，而這個(gè)緩慢的過(guò)程有賴于成骨與破骨之間平衡的保持，涉及具有吸收骨質(zhì)的破骨細(xì)胞、具有成骨功能的成骨細(xì)胞和牙周膜成纖維細(xì)胞復(fù)雜而緊密的偶聯(lián)反應(yīng)。怎樣才能加快牙齒移動(dòng)速度、縮短保持時(shí)間一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者探索的課題。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA對(duì)破骨細(xì)胞有抑制作用[1]。而許多細(xì)胞因子通過(guò)作用于成骨細(xì)胞，從而間接地調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化成熟。由于牙周膜成纖維細(xì)胞具有成骨樣細(xì)胞表型特征[2]，猜想丹參酮ⅡA可能會(huì)對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用。本研究旨在探討丹參酮ⅡA對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞增殖的影響，以期為臨床牙周組織改建提供新的思路和方法。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

α-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco，USA）、丹參酮ⅡA（Sigma，USA），CCK-8 試劑盒（南京凱基公司）、倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）、酶標(biāo)儀（Thermo，USA）、恒溫 CO2培養(yǎng)箱（Thermo，USA）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人牙周膜取自正畸牙的患者，患者年齡12～29歲，刮取牙根中1/3牙周膜，均勻鋪于6孔板內(nèi)，加入含15%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液，飽和濕度、5%CO2、95%空氣，37℃（標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境）孵育，每 3～5天換一次液，直至細(xì)胞從組織塊游離出并長(zhǎng)滿。當(dāng)原代人牙周膜成纖維細(xì)胞約80%融合時(shí)，再以1∶3或1∶4傳代。將第5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人牙周膜成纖維細(xì)胞制成2×108/L細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μl，培養(yǎng) 24 h 后，分別更換為 20、40、60 μg/ml丹參酮ⅡA的α-MEM培養(yǎng)液（每孔100 μl），每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)不含丹參酮ⅡA的空白對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，在相差顯微鏡下觀察各組的細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)丹參酮ⅡA對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖活性的影響 繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，向各孔中加入10 μl新型細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)溶液。37℃下孵育2 h，酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（OD）值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同時(shí)間段采用單因素ANOVA檢驗(yàn)及多樣本均數(shù)間兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度丹參酮ⅡA對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

不同濃度的丹參酮ⅡA作用人牙周膜成纖維細(xì)胞24 h后，對(duì)照組細(xì)胞基本貼壁，細(xì)胞形態(tài)呈梭型；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞僅存少量的貼壁細(xì)胞。培養(yǎng)48 h后，對(duì)照組牙周膜成纖維細(xì)胞基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)孔底；20 μg/ml組中，貼壁細(xì)胞較24 h前增多，細(xì)胞呈梭形；40 μg/ml組與60 μg/ml組培養(yǎng)孔中，僅見(jiàn)少量的貼壁細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則形。培養(yǎng)72 h后，對(duì)照組牙周膜成纖維細(xì)胞完全長(zhǎng)滿培養(yǎng)孔底；20 μg/ml組與 40 μg/ml組中，貼壁細(xì)胞較少，細(xì)胞形態(tài)多樣；60 μg/ml組培養(yǎng)孔中，僅見(jiàn)少許的貼壁細(xì)胞（圖1）。

圖1 人牙周膜成纖維細(xì)胞在不同濃度丹參酮ⅡA中培養(yǎng)24、48、72 h 后的形態(tài)

2.2 不同濃度丹參酮ⅡA對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞增殖活性影響的OD值

加丹參酮ⅡA培養(yǎng)24 h后，不同濃度組的OD值與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各組間兩兩比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。加丹參酮ⅡA培養(yǎng)48、72 h后，不同濃度組的OD值與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；各濃度組間兩兩比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表 1、圖 2）。

表1 不同濃度丹參酮ⅡA對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖活性影響的OD 值（±s）

表1 不同濃度丹參酮ⅡA對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖活性影響的OD 值（±s）

與對(duì)照組比較，*P<0.001

組別 24 h 48 h 72 h對(duì)照組20 μg/ml組40 μg/ml組60 μg/ml組0.560±.0740 0.540±0.230 0.506±0.065 0.509±0.031 0.610±0.038 0.376±0.031*0.376±0.032*0.357±0.020*0.586±0.045 0.303±0.130*0.289±0.045*0.320±0.075*

圖2 不同濃度丹參酮ⅡA對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖活性的影響與對(duì)照組比較，*P<0.001

3 討論

牙周膜細(xì)胞是一組有異質(zhì)性的細(xì)胞群，包括了成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞和牙周膜成纖維細(xì)胞等，其中成骨細(xì)胞和牙周膜成纖維細(xì)胞是牙周組織中的兩種重要的細(xì)胞成分，它們與破骨細(xì)胞一起參與牙周骨質(zhì)平衡的維持，對(duì)于穩(wěn)定正常牙周膜的生理功能起關(guān)鍵作用。

Kwak等[3]研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA通過(guò)調(diào)控成骨細(xì)胞上的NF-κB的配體和骨保護(hù)素來(lái)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的活性。研究還發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA對(duì)破骨細(xì)胞分化的抑制作用是丹參酮ⅡA通過(guò)作用于成骨細(xì)胞，抑制其前列腺素E2/環(huán)氧化酶-2信號(hào)途徑而實(shí)現(xiàn)的。

研究表明，牙周膜成纖維細(xì)胞與成骨細(xì)胞具有相似之處，牙周膜成纖維細(xì)胞有向成骨細(xì)胞分化的趨勢(shì)，在一定情況下，可以表現(xiàn)出成骨細(xì)胞的特征[4-5]。Kanzaki等[6]將末梢血單核細(xì)胞與牙周膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行直接或間接共培養(yǎng)4周，直接共培養(yǎng)體系中牙本質(zhì)片上形成較多的骨吸收陷窩，同時(shí)發(fā)現(xiàn)牙周膜成纖維細(xì)胞可以表達(dá)核因子-κB受體活化因子配體（RANKL）和骨保護(hù)素（OPG）。張丁等[7]也在人牙周膜細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)上發(fā)現(xiàn)RANKL蛋白的表達(dá)，同時(shí)在培養(yǎng)液中檢測(cè)到OPG蛋白，說(shuō)明牙周膜成纖維細(xì)胞可能會(huì)像成骨細(xì)胞一樣，也可以參與破骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)。

近來(lái)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA也參與牙周組織改建。張曉燕等[8]發(fā)現(xiàn)，丹參酮能促進(jìn)牙槽骨骨形成和抑制骨吸收，防治牙槽骨骨質(zhì)疏松。進(jìn)一步說(shuō)明，丹參酮ⅡA、破骨細(xì)胞、牙周膜成纖維細(xì)胞間存在密切的聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示牙周膜成纖維細(xì)胞在丹參酮ⅡA作用48、72 h后，其增殖受到了明顯的抑制，其中以40 μg/ml組最為明顯。先前筆者研究發(fā)現(xiàn)，末梢血單個(gè)核細(xì)胞作為破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，只有在牙周膜成纖維細(xì)胞存在的條件下，才能形成多核的破骨樣細(xì)胞，其單獨(dú)存在無(wú)法形成破骨細(xì)胞[9]。因此，猜測(cè)丹參酮ⅡA有可能通過(guò)抑制牙周膜成纖維細(xì)胞，間接產(chǎn)生抑制破骨細(xì)胞的作用，但是，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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The effect of tanshinoneⅡA on proliferation of human periodontal ligament fibroblasts

CHEN Jian-ming TONG Xiao-jie CHEN Jin
Stomatology of Guangzhou Medical University;Stomatology Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University;Key Laboratory of Oral Medicine,Guangzhou Medical University,Guangzhou 510140,China

ObjectiveTo study the effect of tanshinoneⅡA on proliferation of human periodontal ligament fibroblasts.Methods Human periodontal ligament fibroblasts was cultured in different concentrations of tanshinoneⅡA suspension in vitro (experimental group),control group without tanshinoneⅡA was selected.After 24 h,48 h,72 h,cell proliferation ability was examined by CCK-8.ResultsLess adherent cells were found in experimental groups under an inverted microscope.Meanwhile,after 48 and 72 hours culture,the OD values of experimental groups was lower than that of control group,had significant difference(P<0.001).ConclusionTanshinoneⅡA may inhibit the proliferation of human periodontal ligament fibroblasts.

TanshinoneⅡA;Human periodontal ligament fibroblasts;Periodontal tissue;Remodeling

R780.2

A

1674-4721（2014）04（c）-0021-03

廣東省中醫(yī)藥局資助項(xiàng)目（20121129）

陳建明（1982-），男，漢族，福建人，碩士，主治醫(yī)師，主要從事口腔正畸學(xué)基礎(chǔ)與臨床研究

2014-03-12 本文編輯：郭靜娟）