比較恒溫培養(yǎng)箱和原位雜交儀在EBER原位雜交中的應(yīng)用

陳永欽 鄭宇輝 楊映紅

比較恒溫培養(yǎng)箱和原位雜交儀在EBER原位雜交中的應(yīng)用

陳永欽 鄭宇輝 楊映紅

EBER；原位雜交儀；恒溫培養(yǎng)箱；原位雜交

EBER是EB 病毒編碼的小RNA, 是該病毒的表達(dá)產(chǎn)物,在被感染的細(xì)胞核中以高拷貝數(shù)存在。許多腫瘤性疾病與其感染密切相關(guān), 例如鼻咽癌、NK/T 細(xì)胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、淋巴上皮瘤樣癌等。近年來, 臨床病理診斷越來越依賴原位雜交技術(shù)檢測(cè)病毒是否存在, 但是實(shí)驗(yàn)過程耗時(shí)較長,涉及不同工作溫度。目前大多商品試劑盒的主要設(shè)備是恒溫培養(yǎng)箱, 而利用原位雜交儀尚未普及。本文根據(jù)該技術(shù)的操作特點(diǎn), 將原位雜交儀的操作程序優(yōu)化后用于該技術(shù)并將其應(yīng)用效果與恒溫培養(yǎng)箱作比較。

1 材料與方法

1.1材料 來自福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院病理科, 并且已經(jīng)明確診斷。其中鼻咽癌3例, NK/T 細(xì)胞淋巴瘤9例、霍奇金淋巴瘤2例、 淋巴上皮樣癌6例。每例切片 2 張, 厚度3 μm, 然后隨機(jī)抽取, 將兩張切片分別標(biāo)記為手工組和儀器組。手工組的變性雜交操作在恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行, 儀器組在原位雜交儀上進(jìn)行, 其余步驟一致。

1.2主要試劑和儀器 組織細(xì)胞原位雜交試劑盒(福建泰普生物科學(xué)有限公司)；Statspin Thermo Brite 原位雜交儀；DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱。

1.3方法 兩組切片的前期處理相同, 常規(guī)烤片脫蠟, 水化,甩干切片, 將組織周圍液體用濾紙吸干, 然后滴加適量蛋白酶 K( 與PBS 按 1:25 的比例混勻, 現(xiàn)用現(xiàn)配) 室溫消化5 min,蒸餾水洗滌, 無水乙醇干燥, 用標(biāo)記筆在組織周圍畫圈。然后滴加適量探針雜交液, 手工組將玻片放入濕盒用恒溫培養(yǎng)箱55℃ 孵育80 min, 結(jié)束后調(diào)整溫度, 待溫度降至 37℃ , 雜交過夜, 而儀器組直接在原位雜交儀上, 運(yùn)行已設(shè)定好的程序即55℃ 孵育80 min, 然后 37℃ 雜交過夜。儀器自動(dòng)運(yùn)行。之后PBS 沖洗, 滴加 EBER 一抗(A液)、B 液, C液, 分別孵育30、20、30 min, 每個(gè)步驟后均用 PBS 沖洗3次, 3 min/次。最后進(jìn)行 DAB顯色和常規(guī)蘇木素復(fù)染、封片。

1.4判讀標(biāo)準(zhǔn) 雜交陽性信號(hào)位于細(xì)胞核內(nèi), 呈棕褐色。

2 結(jié)果

在顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 通過比較可以看出：手工組20張切片均觀察到陽性信號(hào)位于細(xì)胞核中, 為棕褐色, 呈深染, 容易辨認(rèn), 非特異性背景少。儀器組20張也均呈陽性,鏡下效果與手工組相似。

3 討論

根據(jù)原位雜交原理, 應(yīng)用已知堿基順序并帶有標(biāo)記物的核酸探針與組織、細(xì)胞中待檢測(cè)的核酸按堿基配對(duì)原則進(jìn)行特異性結(jié)合而形成雜交體, 再利用與標(biāo)記物相應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行顯示處理, 從而達(dá)到檢測(cè)目的。這一技術(shù)具有很高的敏感性和特異性。Khan［1］認(rèn)為, 原位雜交技術(shù)是組織學(xué)材料中檢測(cè) EB病毒的金標(biāo)準(zhǔn), 在檢測(cè)時(shí)具有定位作用, 能夠確定病毒與組織和細(xì)胞的關(guān)系。在確定與疾病的關(guān)系時(shí), 原位雜交已成為公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)方法［2］。雖然此技術(shù)過程比較繁瑣,但與蛋白水平檢測(cè)相比, 具有明顯的優(yōu)越性, 其關(guān)鍵步驟在于變性雜交過程。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中, 利用恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行變性雜交可以看出:在55℃ 孵育結(jié)束后, 需要人為二次設(shè)定溫度并且只有等到溫度降到37 ℃之后才能進(jìn)一步操作, 這過程需要消耗一定時(shí)間。而利用原位雜交儀, 事先設(shè)定好程序, 儀器可以在55℃ 孵育結(jié)束后自動(dòng)降至37℃, 降溫快, 不需要人為二次設(shè)定溫度。所以, 經(jīng)過比較作者認(rèn)為, 恒溫培養(yǎng)箱雖然作為病理科技術(shù)室的重要設(shè)備, 其成本低, 應(yīng)用范圍廣, 已在基層醫(yī)院普及, 但在進(jìn)行EBER原位雜交時(shí), 利用恒溫培養(yǎng)箱人工操作步驟較多, 周圍環(huán)境溫度等條件也容易影響操作過程, 延長整個(gè)實(shí)驗(yàn)的時(shí)間, 進(jìn)而可能影響結(jié)果,導(dǎo)致重復(fù)性不夠理想。而原位雜交儀雖然儀器成本較高, 不易在基層醫(yī)院普及, 但操作簡單, 程序靈活多變, 結(jié)果穩(wěn)定,重復(fù)性好, 應(yīng)作為首選設(shè)備。

參考文獻(xiàn)

［1］ Khan G.Screening for Epstein- Barr virus in Hodgkin’ s lymphoma.Methods Mol Biol, 2009(511):311-322.

［2］ 周小鴿, 張小平, 張勁松.EB 病毒及其相關(guān)疾病.診斷病理學(xué)雜志, 2001, 8(1):58-59.

2014-05-13］

350001 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院病理科