張 慧， 孫紅英

生物膜中白念珠菌的耐藥性研究

張 慧， 孫紅英

生物膜； 白念珠菌； 耐藥機制

白念珠菌（Canida albicans）是人類最常見的條件致病真菌，健康者帶菌率以口腔最高，約80%［1］。當機體免疫力下降或使用免疫抑制劑時，白念珠菌可導致嚴重的感染性疾病，在美國醫(yī)院感染中列第4位，其病死率為30%～70%［2-3］。研究發(fā)現(xiàn)，在難治性白念珠菌感染的病灶中大多存在生物膜。自然界中99%微生物以生物膜的形式存在，65%人類感染性疾病與生物膜相關(guān)［4］。

白念珠菌生物膜是單個細菌細胞黏附于載體或有機體表面形成的三維立體結(jié)構(gòu)，是由細菌細胞外基質(zhì)包裹而成的菌落。生物膜作為一種屏障，使其內(nèi)部的菌落得以逃避機體防御系統(tǒng)的攻擊，躲避抗菌藥物的殺傷作用，導致久治不愈及細菌耐藥性的出現(xiàn)［5］。明確生物膜內(nèi)白念珠菌的耐藥機制，對預防生物膜形成，治療生物膜內(nèi)白念珠菌導致的感染性疾病均具有重大意義。

一、耐藥機制研究

（一）白念珠菌生物膜對藥物敏感性的影響Hawser等［6］研究發(fā)現(xiàn)，使生物膜內(nèi)細菌減少50%時所需的藥物濃度是浮游菌的5～8倍，生物膜內(nèi)白念珠菌對于真菌藥物的敏感性是浮游菌的1／30～ 1／20 000。

目前，生物膜內(nèi)白念珠菌對藥物敏感性的研究主要采用的XTT鈉鹽減低法，是一種簡單、高效而經(jīng)濟的標準檢測方法。Ramage等［7］利用XTT鈉鹽減低法證實，與浮游菌相比，即使兩性霉素B的濃度提高1～32倍，生物膜內(nèi)白念珠菌對藥物仍不敏感，且兩性霉素B濃度達到最大（16 mg／L）時也不可能完全去除生物膜。Konopka等［8］研究結(jié)果顯示氟康唑的濃度達到100 mg／L，生物膜內(nèi)白念珠菌的活性下降僅20%左右。Lamfon等［9］證實生物膜內(nèi)白念珠菌對氟康唑的耐藥性是浮游菌的1 000多倍。生物膜的形成使藥物敏感性明顯下降，故研究耐藥性機制頗為重要。

（二）生物膜中白念珠菌耐藥機制研究現(xiàn)狀 目前，生物膜內(nèi)白念珠菌耐藥機制主要包括生物膜中白念珠菌細胞的密度、藥物靶點的過度表達、藥物外排泵基因的表達、細胞外基質(zhì)等多種因素［10］。

1．細胞的密度：Perumal等［11］基于細胞密度影響生物膜耐藥性的假設，通過實驗證實了高密度的細胞量對生物膜中白念珠菌的藥物敏感性具有顯著的意義。Seneviratne等［12］同樣證實了這一點，細胞密度降低了生物膜內(nèi)白念珠菌對酮康唑和5氟胞嘧啶的敏感性。

但細胞密度只是生物膜內(nèi)白念珠菌復雜耐藥機制的一個方面，生物膜內(nèi)白念珠菌的耐藥機制包含多方面，相互交叉。

2．藥物靶點的過度表達：唑類藥物對白念珠菌具有抑菌作用，存活的菌群可發(fā)生自然選擇，導致生物膜內(nèi)細菌對高濃度唑類藥物耐藥。Nailis等［13］在一項藥物特異性轉(zhuǎn)錄反應試驗中，利用實時定量RT-PCR檢測到在高濃度氟康唑作用下基因ERG1、ERG3、ERG11和ERG25表達上升；在兩性霉素B作用下基因SK N1、KRE1和ERG1表達上升。成熟和未成熟生物膜內(nèi)白念珠菌在氟康唑的作用下，編碼麥角固醇生物膜合成酶相關(guān)的基因ERG1、ERG3、ERG11、ERG25表達水平均有所升高，導致生物膜內(nèi)白念珠菌對氟康唑產(chǎn)生耐藥性。

Yu等［14］發(fā)現(xiàn)成熟生物膜內(nèi)白念珠菌在法尼醇（白念珠菌的一種群體感應分子，是麥角固醇的前體物質(zhì)）作用下表現(xiàn)出對氟康唑的敏感性，RT-PCR檢測結(jié)果顯示，在法尼醇作用下ERG1、ERG3、ERG6、ERG11和ERG25表達水平的明顯下降，說明麥角固醇的生物合成可阻止法尼醇的作用，而EGR基因表達水平的提高可增加生物膜內(nèi)白念珠菌的耐藥性。

3．外排泵基因的表達：藥物外排泵基因的表達上升被認為與生物膜內(nèi)白念珠菌的耐藥性密切相關(guān)。編碼多重耐藥性轉(zhuǎn)運體的基因，MDR1、CDR1和CDR2在耐氟康唑類藥物的未成熟生物膜內(nèi)白念珠菌中表達水平增高，但是這只存在于未成熟生物膜內(nèi)白念珠菌中，在成熟生物膜（大于48 h）內(nèi)白念珠菌中敲除上述單個基因或聯(lián)合敲除2個或以上基因，高水平的耐藥性未受到任何影響。

4．細胞外基質(zhì)：和細菌生物膜類似，白念珠菌生物膜的細胞外基質(zhì)在維持生物膜結(jié)構(gòu)的完整性及藥物敏感性方面具有重要的作用［15］?？扇苄驭?1，3葡聚糖是白念珠菌生物膜胞外基質(zhì)的重要組成部分，可與唑類和多烯類藥物發(fā)生螯合作用，進而阻止藥物的滲入，引起耐藥性反應［16-18］。

與浮游菌相比，生物膜內(nèi)白念珠菌可產(chǎn)生更多的可溶性β-1，3葡聚糖，培養(yǎng)浮游菌時加入外源性可溶性β-1，3葡聚糖可明顯提高生物膜內(nèi)白念珠菌對氟康唑的最低抑菌濃度，而在生物膜中加入葡聚糖酶可提高對唑類藥物的敏感性［19］。

總之，生物膜內(nèi)白念珠菌耐藥機制復雜多樣，但目前仍存在很多有爭議的地方，如Yu等［14］發(fā)現(xiàn)在法尼醇（麥角甾醇的前體）的作用下成熟生物膜內(nèi)白念珠菌對氟康唑的敏感性增加。然而麥角甾醇并不參與棘白菌素抑制成熟生物膜中真菌細胞壁成分β葡聚糖的合成。目前，仍有很多未知的生物膜內(nèi)白念珠菌的耐藥機制。

二、生物膜中耐藥株對耐藥性的影響

（一）白念珠菌生物膜中耐藥株的存在 近年研究報道，除上述生物膜內(nèi)白念珠菌的耐藥機制外，還存在一些高度耐藥的細胞亞群。LaFleur等［20］提出在真菌生物膜中存在一種高度耐藥的細胞亞群，有趣的是這種細胞亞群僅存在于成熟生物膜（大于48 h）中，在浮游菌中未檢測到，稱之為耐藥株（persister），是表型的變異而非基因突變，僅占細胞總量的1%左右。耐藥株受到生物膜中細胞外基質(zhì)的保護作用，在藥物濃度下降后會重新形成生物膜。在慢性感染遷延不愈中耐藥株具有重要的作用。

同時研究發(fā)現(xiàn)，缺少Efg1p、Cph1p或Mkc1p的白念珠菌可形成缺陷型生物膜，即使efg1Δ／cph1Δ雙突變株仍可產(chǎn)生耐藥株，即耐藥株的出現(xiàn)與生物膜的復雜結(jié)構(gòu)無關(guān)，黏附于載體表面就足以產(chǎn)生耐藥株［20］。有學者通過體外建立細菌生物膜的數(shù)字化模型發(fā)現(xiàn)，生物膜越厚，所產(chǎn)生的耐藥株數(shù)量越多，在缺乏營養(yǎng)物質(zhì)的區(qū)域，活細胞無法生長但可自發(fā)地轉(zhuǎn)變?yōu)槟退幹辏跍\層生物膜中細胞的生長速度超過了其轉(zhuǎn)變?yōu)槟退幹甑乃俣?，即耐藥株在生物膜中的分布是不均一的，真菌生物膜中是否存在這一現(xiàn)象需進一步驗證。

Al-Dhaheri等［21］選用6種不同的念珠菌：白念珠菌GDH2346、白念珠菌SC5314、光滑念珠菌AAHB12、熱帶念珠菌AAHB73、近平滑念珠菌AAHB4479和克柔念珠菌，以兩性霉素B為抗菌藥物，結(jié)果顯示只有克柔念珠菌、近平滑念珠菌生物膜中發(fā)現(xiàn)耐藥株，而白念珠菌SC5314和光滑念珠菌生物膜中未發(fā)現(xiàn)耐藥株，同時該實驗無法確定白念珠菌GDH2346生物膜中是否存在耐藥株。這說明耐藥株在念珠菌生物膜中并非普遍存在，在野生型白念珠菌生物膜中是否普遍存在這一問題，尚無研究證實。

（二）生物膜中耐藥株的產(chǎn)生 生物膜中耐藥株的形成已成為其多重耐藥性研究的焦點，但耐藥株形成的具體機制尚不清楚。

白念珠菌生物膜中耐藥株的形成與生物膜復雜的結(jié)構(gòu)無關(guān)，而與白念珠菌對載體的黏附性密切相關(guān)。白念珠菌細胞從感應載體到附著在載體表面開始，細胞表面的黏附分子與附著表面的細菌特異性結(jié)合，促進耐藥株的形成。已有研究表明，參與白念珠菌黏附過程的信號通路主要有MAPK和Rasc AMP兩條信號傳導途徑［22］。

研究白念珠菌黏附過程的重要信號傳導途徑，有望找到耐藥株形成的關(guān)鍵基因，進而找到新的藥物治療靶點，可以解決生物膜內(nèi)白念珠菌多重耐藥性的種種難題。

（三）生物膜中耐藥株的耐藥性 阻斷生物膜中耐藥株的生成可能成為一種解決生物膜內(nèi)白念珠菌高度耐藥的重要途徑之一，目前關(guān)于耐藥株耐藥性具體機制的觀點上不統(tǒng)一。

1．超氧化物歧化酶與活性氧自由基對耐藥株耐藥性的影響：Bink等［23］發(fā)現(xiàn)高濃度的咪康唑可使白念珠菌野生株生物膜中的耐藥株數(shù)量占細胞總量的1%～2%，超氧化物歧化酶（superoxide dismutases，Sods）在白念珠菌生物膜中受基因SOD的編碼，對活性氧自由基（ROS）的降解具有重要的作用，在咪康唑的作用下Sods可上調(diào)基因SOD的表達水平，研究中使用Sods的抑制劑N，N-二乙基二硫代氨基甲酸（N，N’-diethyldithiocarbamate，DDC）可對咪康唑耐藥的耐藥株減少為原來的1／18，而ROS水平提高。

D?rr等［24］證實SOS基因系統(tǒng)可誘導耐藥株的形成，當菌體DNA受到嚴重損傷、處于危急狀態(tài)時Rec A蛋白被激活，SOS基因表達，修復損傷的DNA，即SOS修復，使菌體在抗菌藥物作用下能夠繼續(xù)存活，成為耐藥株，是耐藥株形成的重要機制，但不同抗菌藥物對耐藥株形成的機制并不相同。Lex A蛋白是主要的SOS反應調(diào)節(jié)劑，作為轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白行使功能直至DNA損傷激活Rec A，Rec A介導Lex A自我消化，從而允許SOS基因表達。Wu等［25］在氧應激對耐藥株耐受性影響的實驗中發(fā)現(xiàn)lex A3變異株缺乏SOS應激反應時耐藥株的耐藥性下降，證實了Lex A蛋白在SOS反應中的作用。

研究發(fā)現(xiàn)亞抑菌濃度抗菌藥物治療可產(chǎn)生ROS，ROS直接損傷DNA，激活SOS反應，導致耐藥株的產(chǎn)生。van der Veen等［26］也指出SOS反應受ROS的影響。由此可見，ROS及SOS反應在真菌生物膜耐藥株形成過程中具有重要作用，但具體研究機制目前鮮見報道。

2．組蛋白脫乙?；敢种苿δ退幹昴退幮缘挠绊懀航M蛋白脫乙?；福╤istone deacetylase，HDA）抑制劑，如丙酸、曲古抑菌素A和丁酸，可誘導哺乳動物細胞中的細胞凋亡。Al-Dhaheri等［27］用熒光素二醋酸標志生物膜，發(fā)現(xiàn)在兩性霉素B的作用下成熟生物膜中仍存在少量活細胞，加入HDA抑制劑后兩性霉素B的藥效明顯提高，生物膜內(nèi)真菌對兩性霉素B的敏感性也提高，鏡下觀察到耐藥株出現(xiàn)凋亡，但具體機制尚不清楚。HAD抑制劑引起真菌生物膜中耐藥株凋亡，可能成為抗耐藥株的有效藥物。

3．生物膜中分子間的相互作用：生物膜中耐藥株并非獨立存在，單獨發(fā)揮耐藥性。Balaban等［28］發(fā)現(xiàn)在生物膜中，耐藥株和非耐藥株共同存在，彼此之間相互作用，形成一個復雜的網(wǎng)絡系統(tǒng)，促進或阻斷某一分子的活性，可能對耐藥株的耐藥性產(chǎn)生抑制作用，因此，生物膜中分子之間的相互作用有望成為探尋新型治療方法的途徑之一。

三、總結(jié)

綜上所述，生物膜內(nèi)白念珠菌的耐藥機制包括生物膜中真菌細胞的密度、藥物靶點的過度表達、藥物外排泵基因的表達、細胞外基質(zhì)等多種因素，是多種機制相互作用的結(jié)果。而生物膜中耐藥株的提出，使耐藥機制更加復雜。然而并不是所有生物膜中的白念珠菌都可產(chǎn)生耐藥株，因此，白念珠菌生物膜中耐藥株的產(chǎn)生量將成為其耐藥性大小的決定因素之一［21］。

研究發(fā)現(xiàn)在癌癥患者中口腔白念珠菌感染時間越長，分離得到的耐藥株數(shù)量越多［29］。在錯綜復雜的耐藥機制中，生物膜內(nèi)白念珠菌耐藥株的發(fā)現(xiàn)對其耐藥機制提供了新的研究熱點和治療策略，白念珠菌感染導致的慢性炎癥性疾病往往遷延不愈，是否與生物膜內(nèi)白念珠菌耐藥株的產(chǎn)生相關(guān)，目前尚無法定論，因此，明確生物膜中白念珠菌耐藥株形成的機制及耐藥機制對尋找新型治療藥物具有重大意義。但是如何從白念珠菌生物膜中快捷分離到高數(shù)量的耐藥株，及對耐藥株形成及耐藥性機制尚需進一步研究。

［1］ Samaranayake L．Commensal oral Candida in Asian cohorts［J］．Int J Oral Sci，2009，1（1）：2-5．

［2］ Tragiannidis A，Tsoulas C，Kerl K，et al．Invasive candidiasis：update on current pharmacotherapy options and futureperspectives［J］．Expert Opin Pharmacother，2013，14（11）：1515-1528．

［3］ Bouza E，Burillo A，Mu?oz P，et al．Mixed bloodstream infections involving bacteria andCandidaspp［J］．J Antimicrob Chemother，2013，68（8）：1881-1888．

［4］ Potera C．Forging a link between biofilms and disease［J］．Science，1999，283（5409）：1837-1839．

［5］ Hoiby，N，Bjarnsholt T，Givskov M，et al．Antibiotic resistance of bacterial biofilms［J］．Int J Antimicrob Agents，2010，35（4）：322-332．

［6］ Hawser SP，Douglas LJ．Resistance ofCandida albicansbiofilms to antifungal agentsin vitro［J］．Antimicrob Agents Chemother，1995，39（9）：2128-2131．

［7］ Ramage G，vande Walle K，Wickes BL，et al．Standardized method forin vitroantifungal susceptibility testing ofCandida albicansbiofilms［J］．Antimicrob Agents Chemother，2001，45（9）：2475-2479．

［8］ Konopka K，Dorocka-Bobkowska B，Gebremedhin S，et al．Susceptibility ofCandidabiofilms to histatin 5 and fluconazole［J］．Antonie Van Leeuwenhoek，2010，97（4）：413-417．

［9］ Lamfon H，Porter SR，McCullough M，et al．Susceptibility ofCandida albicansbiofilms grown in a constant depth film fermentor to chlorhexidine，fluconazole and miconazole：a longitudinal study［J］．J Antimicrob Chemother，2004，53（2）：383-385．

［10］ Ramage G，Rajendran R，Sherry L，et al．Fungal biofilm resistance［J］．Int J Microbiol，2012，2012：528521．

［11］ Perumal P，Mekala S，Chaffin WL．Role for cell density in antifungal drug resistance inCandida albicansbiofilms［J］．Antimicrob Agents Chemother，2007，51（7）：2454-2463．

［12］ Seneviratne CJ，Jin L，Samaranayake LP．Biofilm lifestyle of Candida：a mini review［J］．Oral Dis，2008，14（7）：582-590．

［13］ Nailis H，KucharikováS，RicicováM，et al．Real-time PCR expression profiling of genes encoding potential virulence factors inCandida albicansbiofilms：identification of model-dependent and-independent gene expression［J］．BMC Microbiol，2010，10：114．

［14］ Yu LH，Wei X，Ma M，et al．Possible inhibitory molecular mechanism of farnesol on the development of fluconazole resistance inCandida albicansbiofilm［J］．Antimicrob Agents Chemother，2012，56（2）：770-775．

［15］ Flemming HC，Wingender J．The biofilm matrix［J］．Nat Rev Microbiol，2010，8（9）：623-633．

［16］ Vediyappan G，Rossignol T，d′Enfert C．Interaction ofCan-dida albicansbiofilms with antifungals：transcriptional response and binding of antifungals to beta-glucans［J］．Antimicrob Agents Chemother，2010，54（5）：2096-2111．

［17］ Nett JE，Crawford K，Marchillo K，et al．Role of Fks1p and matrix glucan inCandida albicansbiofilm resistance to an echinocandin，pyrimidine，and polyene［J］．Antimicrob A-gents Chemother，2010，54（8）：3505-3508．

［18］ Nett JE，Sanchez H，Cain MT，et al．Genetic basis ofCandidabiofilm resistance due to drug-sequestering matrix glucan［J］．J Infect Dis，2010，202（1）：171-175．

［19］ Nett J，Lincoln L，Marchillo K，et al．Beta-1，3 glucan as a test for central venous catheter biofilm infection［J］．J Infect Dis，2007，195（11）：1705-1712．

［20］ LaFleur MD，Kumamoto CA，Lewis K．Candida albicansbiofilms produce antifungal-tolerant persister cells［J］．Antimicrob Agents Chemother，2006，50（11）：3839-3846．

［21］ Al-Dhaheri RS，Douglas LJ．Absence of amphotericin B-tolerant persister cells in biofilms of someCandidaspecies［J］．Antimicrob Agents Chemother，2008，52（5）：1884-1887．

［22］ Finkel JS，Mitchell AP．Genetic control ofCandida albicansbiofilm development［J］．Nat Rev Microbiol，2011，9（2）：109-118．

［23］ Bink A，Vandenbosch D，Coenye T，et al．Superoxide dismutases are involved inCandida albicansbiofilm persistence against miconazole［J］．Antimicrob Agents Chemother，2011，55（9）：4033-4037．

［24］ D?rr T，Lewis K，Vulic M．SOS response induces persistence to fluoroquinolones inEscherichia coli［J］．PLoS Genet，2009，5（12）：e1000760．

［25］ Wu Y，Vulic＇M，Keren I，et al．，Role of oxidative stress in persister tolerance［J］．Antimicrob Agents Chemother，2012，56（9）：4922-4926．

［26］ van der Veen S，Abee T．Bacterial SOS response：a food safety perspective［J］．Curr Opin Biotechnol，2011，22（2）：136-142．

［27］ Al-Dhaheri RS，Douglas LJ．Apoptosis inCandidabiofilms exposed to amphotericin B［J］．J Med Microbiol，2010，59（Pt 2）：149-157．

［28］ Balaban NQ．Persistence：mechanisms for triggering and enhancing phenotypic variability［J］．Curr Opin Genet Dev，2011，21（6）：768-775．

［29］ Lafleur MD，Qi Q，Lewis K．Patients with long-term oral carriage harbor high-persister mutants ofCandida albicans［J］．Antimicrob Agents Chemother，2010，54（1）：39-44．

Antibiotic resistance ofCandida albicansin biofilm

ZHANG Hui，SUN Hongying．
（Department of Dentistry，Huashan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai200040，China）

R378

A

1009-7708（2014）04-0361-04

2013-09-23

上海市科委西醫(yī)引導類基金（編號：134119a8700）；2013年復旦大學第十三批研究生創(chuàng)新基金。

復旦大學附屬華山醫(yī)院口腔科，上海 200040。

張慧（1986—），女，在讀碩士，主要從事口腔白念珠菌的研究。

孫紅英，E-mail：huashan110926＠163．com。