江蘇省蘇北人民醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，江蘇 揚(yáng)州 225001

乳腺癌中BRCA1、GSTP1和MGMT基因甲基化檢測(cè)的臨床意義

符德元 魏金麗 祝玉祥 譚好升 章佳新

江蘇省蘇北人民醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，江蘇 揚(yáng)州 225001

背景與目的：DNA甲基化是1種調(diào)節(jié)基因表達(dá)的重要機(jī)制，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。研究表明，在腫瘤診斷、預(yù)后及療效判斷方面，DNA甲基化是1種有潛在應(yīng)用價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物。本研究通過(guò)對(duì)乳腺癌中組織標(biāo)本中BRCA1，GSTP1和MGMT這3種與DNA修復(fù)功能有關(guān)基因的甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。方法：在106例配對(duì)的乳腺癌及癌旁組織中，運(yùn)用甲基化特異性PCR法，對(duì)BRCA1、GSTP1和MGMT基因的甲基化狀況進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)分析它們與乳腺癌主要臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果：在乳腺癌組織標(biāo)本中，BRCA1、GSTP1和MGMT的甲基化頻率分別為24.5%(26/106)、29.2%(31/106)和18.9%(20/106)，明顯高于對(duì)應(yīng)癌旁組織7.5%(8/106)、11.3%(12/106)和4.7%(5/106)的甲基化頻率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。在腫瘤組織和癌旁組織中，至少有1種基因發(fā)生甲基化的分別為50.9%(54/106)和19.8%(21/106)，每個(gè)標(biāo)本的平均甲基化數(shù)分別為0.73和0.24，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.000 1)。BRCA1基因甲基化與患者的年齡及ER(-)呈顯著正相關(guān)(P=0.007和0.020)；MGMT基因甲基化與乳腺癌分期、組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)(P=0.016，0.025和0.030)；GSTP1基因甲基化與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小呈顯著正相關(guān)(P=0.028和0.033)；同時(shí)有超過(guò)1種基因甲基化與乳腺癌較晚的病理分期及淋巴轉(zhuǎn)移正相關(guān)(P=0.028和0.007)。結(jié)論：BRCA1、GSTP1和MGMT基因甲基化狀況與乳腺癌臨床病理特征顯著相關(guān)，同時(shí)存在多個(gè)基因甲基化預(yù)示著乳腺癌具有侵襲性表型，聯(lián)合檢測(cè)3者的甲基化狀況可能對(duì)乳腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)具有重要價(jià)值。

乳腺癌；甲基化；甲基化特異性PCR

近年來(lái)，啟動(dòng)子甲基化在乳腺癌的輔助診斷、療效觀察、預(yù)后評(píng)估方面的臨床意義已被眾多學(xué)者廣泛研究。但多數(shù)研究都集中在一個(gè)單一的候選基因，而且研究結(jié)果不盡相同。目前研究認(rèn)為，與單基因相比，多個(gè)腫瘤相關(guān)基因及CpG位點(diǎn)的聯(lián)合檢測(cè)更有利于揭示腫瘤分子病理機(jī)制和臨床特征分型［1］。在乳腺癌形成及其侵襲性不斷增強(qiáng)的過(guò)程中，一些重要的基因，如參與DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞黏附以及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能的基因，都可能因?yàn)槠鋯?dòng)子區(qū)CpG島的甲基化而發(fā)生功能失活［2-3］。臨床上，進(jìn)一步探索研究相關(guān)基因功能改變與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及其惡性特征的關(guān)系，有助于我們對(duì)乳腺癌演進(jìn)的認(rèn)識(shí)和理解，同時(shí)對(duì)探尋有價(jià)值的診斷及預(yù)后標(biāo)志物具有重要意義。本研究重點(diǎn)探討3種與DNA修復(fù)功能有關(guān)的基因：BRCA1、GSTP1和MGMT在乳腺癌中甲基化情況，分析這些基因甲基化狀態(tài)與乳腺癌主要臨床病理特征之間的關(guān)系，探討這3種基因DNA異常甲基化在乳癌發(fā)生、發(fā)展中的潛在作用。

1 材料和方法

1. 1 標(biāo)本來(lái)源

選取江蘇省蘇北人民醫(yī)院甲狀腺乳腺外科2010年8月—2011年10月間經(jīng)手術(shù)切除的乳腺標(biāo)本，術(shù)中立即取材，標(biāo)本放入液氮中速凍后-80 ℃條件下保存待檢。所取標(biāo)本包括106例乳腺癌組織及其距離癌組織邊緣5 cm以上的癌旁正常組織。患者均為女性，年齡在26～75歲之間，平均48.4歲。所有患者術(shù)前未接受化療、放療及其他抗癌治療。所有標(biāo)本術(shù)后均經(jīng)病理科醫(yī)師確診。乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌分級(jí)與分期參照乳腺癌WHO分類和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。樣本獲得了倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并簽署知情同意書(shū)。

1.2 DNA抽提和DNA的亞硫酸鹽處理

本研究采用 DNeasy 組織試劑盒(250) (QIAGEN，Cat. No. 69506)抽提人組織細(xì)胞基因組DNA。應(yīng)用EZ DNA Methylation-Gold試劑盒處理200～500 ng DNA。均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 甲基化特異性PCR和電泳分析

甲基化特異性PCR擴(kuò)增基因的引物序列見(jiàn)表1。在15 μL的反應(yīng)體系中，加入經(jīng)亞硫酸鹽修飾的DNA模板1.5 μL，10×緩沖液1.5 μL(含Mg2+)，20 mmol/L的dNTPs 0.45 μL，20 nmol/L的上、下游引物各0.15 μL，Hotstar Taq DNA聚合酶0.12 μL，用雙蒸水調(diào)整體系，使終體積為15 μL。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%的瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)攝像保存。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中以SssⅠ甲基化酶處理的DNA作為甲基化的陽(yáng)性對(duì)照，以經(jīng)全基因組擴(kuò)增的健康成人外周血淋巴細(xì)胞DNA作為未甲基化的陰性對(duì)照。出現(xiàn)甲基化特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物，為甲基化(M)；僅出現(xiàn)非甲基化特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物，為非甲基化(U)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。平均每個(gè)乳腺癌組織或配對(duì)癌旁組織基因甲基化頻率差異采用t檢驗(yàn)；各基因甲基化情況與乳腺癌主要臨床病理特征之間的關(guān)系運(yùn)用Fisher精確檢驗(yàn)；所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌及其配對(duì)癌旁組織中3種基因甲基化分析

3種基因在乳腺癌組織中甲基化特異性PCR的代表性結(jié)果見(jiàn)圖1。在乳腺癌組織中，BRCA1、GSTP1和MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)在甲基化發(fā)生率分別為24.5%、29.2%和18.9%；在癌旁組織中分別為7.5%、11.3%和4.7%，均較對(duì)應(yīng)的癌組織低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖2)。

在癌組織中，3種基因中至少有1種基因發(fā)生甲基化的有54例，占50.9%(54/106)，僅有1種基因發(fā)生甲基化的占34%(36/106)，2種基因甲基化的占12.3%(13/106)，3種基因甲基化的占4.7%(5/106)。在配對(duì)癌旁組織中，3種基因中至少有1種基因發(fā)生甲基化的有21例，占19.8%(21/106)，1種基因甲基化占16.0%(17/106)，2種基因甲基化占3.8%(4/106)，無(wú)3種基因發(fā)生甲基化。每例癌和癌旁組織平均甲基化數(shù)目在癌組織中為0.73，癌旁組織為0.24，2者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.000 1，表2)。此外，我們對(duì)3種基因間甲基化的相關(guān)性做了分析，發(fā)現(xiàn)基因BRCA1和MGMT(P=0.018)在乳腺癌中甲基化存在相關(guān)性。

2.2 乳腺癌中多基因甲基化與乳腺癌主要臨床病理特征之間的關(guān)系

這3種基因的異常甲基化與乳腺癌病理類型、PR及HER-2狀態(tài)均無(wú)顯著相關(guān)性。BRCA1基因甲基化與患者的年齡及ER受體狀態(tài)相關(guān)(37.8% vs 17.4%；P=0.020)，在年輕及ER(-)乳癌患者中BRCA1基因甲基化占較高比例(33.3% vs 10%；P=0.007)；MGMT基因甲基化與乳腺癌分期、組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著相關(guān)(P=0.016，0.025和0.030)；GSTP1基因甲基化與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小呈顯著相關(guān)(P=0.028和0.033，表3)。

根據(jù)單個(gè)基因分析結(jié)果，本研究對(duì)≤1個(gè)基因甲基化和＞1個(gè)基因甲基化時(shí)與主要臨床病理特征進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，同時(shí)有超過(guò)1個(gè)基因甲基化與乳腺癌較晚的病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P=0.028和0.007，表3)。

3 討 論

乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)涉及多基因改變和多階段致癌的復(fù)雜過(guò)程，其中癌基因的激活和抑癌基因的失活在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。除遺傳因素外，基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的異常甲基化已被認(rèn)為是抑癌基因沉默的主要機(jī)制［4］。在乳腺癌中，一些已知和公認(rèn)的基因，包括執(zhí)行DNA修復(fù)，細(xì)胞周期調(diào)控，細(xì)胞黏附，激素和受體介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能的基因，被認(rèn)為常因啟動(dòng)子甲基化而發(fā)生功能失活［2-3］。眾多研究表明，基因異常甲基化是有前途的生物標(biāo)志物，對(duì)乳腺癌病因，診斷以及治療的選擇具有重要意義［5-6］。

本研究中，GSTP1、BRCA1和MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)在甲基化發(fā)生率分別為29.2%、24.5%和18.9%，均明顯高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織(P＜0.01)。在50.9%的乳腺癌組織中至少存在1個(gè)基因發(fā)生甲基化。在配對(duì)乳腺癌和癌旁標(biāo)本中，每個(gè)標(biāo)本平均甲基化數(shù)分別為0.73和0.24，2者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001，表2)。而且，我們發(fā)現(xiàn)BRCA1基因甲基化狀況與MGMT基因甲基化之間存在顯著相關(guān)性(P=0.018)，支持CpG島啟動(dòng)子甲基化異常不會(huì)隨機(jī)在乳腺癌中發(fā)生的假設(shè)，多基因同步甲基化可能是乳腺癌的1個(gè)非常重要的特性［7］。這些基因之間的協(xié)同作用以及其所屬的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和(或)轉(zhuǎn)移中存在關(guān)聯(lián)，仍有待進(jìn)一步研究。

從基因功能上來(lái)看，BRCA1、GSTP1和MGMT基因都執(zhí)行DNA修復(fù)基因功能。在許多研究中，這3種基因甲基化在乳腺癌中的臨床意義已得到證實(shí)［8-9］。本研究結(jié)果同樣顯示這些基因的異常甲基化與某些主要的臨床病理特征密切相關(guān)。有研究表明，BRCA1基因甲基化多在乳腺癌和卵巢癌中發(fā)生，具有明顯的組織特異性［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，在年輕的乳腺癌患者中，BRCA1基因甲基化較為多見(jiàn)，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相一致［11-13］。而且多數(shù)BRCA1基因甲基化患者ER陰性(P=0.020)，暗示BRCA1基因甲基化與ER通路之間存在相互作用。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶P1(GSTP1)屬于代謝酶家族，參與代謝，解毒等功能，能消除入侵機(jī)體的有毒物質(zhì)，可以防止細(xì)胞的DNA的損傷和抑制癌變［14］。研究證實(shí)，乳腺癌中GSTP1常因其啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化而導(dǎo)致其表達(dá)沉默，而且該基因發(fā)生甲基化常預(yù)示著乳腺癌患者的預(yù)后較差［15-16］。本研究結(jié)果也顯示，GSTP1甲基化與乳腺癌患者的腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)。

MGMT基因的表達(dá)產(chǎn)物MGUT酶是人類DNA修復(fù)系統(tǒng)中最重要的直接修復(fù)酶，MGMT的正常表達(dá)是機(jī)體細(xì)胞修復(fù)烷化損害，維持基因組DNA穩(wěn)定性的重要基礎(chǔ)。MGMT表達(dá)喪失，可以導(dǎo)致DNA在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄過(guò)程所發(fā)生的錯(cuò)誤積累，引起基因組的不穩(wěn)定性， 使癌相關(guān)基因激活，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展［17］。在乳腺癌中，MGMT基因常因甲基化而導(dǎo)致其表達(dá)缺失，而且其甲基化與乳腺癌的惡性生物學(xué)特征密切相關(guān)［18］。本研究結(jié)果也顯示，MGMT甲基化與乳腺癌臨床分期，組織學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，表明其對(duì)乳腺癌的進(jìn)展具有重要影響。

研究表明在許多惡性腫瘤中，如果同時(shí)存在多個(gè)基因甲基化，往往預(yù)示著患者預(yù)后較差［19］。本研究對(duì)BRCA1、GSTP1和MGMT這3種基因進(jìn)行聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)只要這3種基因中存在1種以上的基因甲基化，則這些患者通常都伴有較晚的腫瘤分期或者伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果表明，這種與DNA修復(fù)功能有關(guān)的基因的異常甲基化在乳腺癌進(jìn)展過(guò)程中具有重要作用，聯(lián)合檢測(cè)這些基因的甲基化發(fā)生情況對(duì)指導(dǎo)乳腺癌的治療、預(yù)測(cè)其預(yù)后具有重要的臨床意義。

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Clinical signi fi cance of BRCA1, GSTP1 and MGMT gene methylation status in breast cancer

FU Deyuan, WEI Jin-li, ZHU Yu-xiang, TAN Hao-sheng, ZHANG Jia-xin
(Department of Thyroid and Breast Surgery, Subei People’s Hospital of Jiangsu Province, Yangzhou Jiangsu 225001, China)

FU De-yuan E-mail: fdy1003@163.com

Background and purpose: DNA methylation is an important mechanism for regulating gene expression, and plays an important role in the tumorigenesis. Study shows that DNA methylation is a potentially promising biomarker in tumor diagnosis, prognosis as well as treatment selection. This study aimed to analyze the methylation status and assessed possible clinical value of 3 DNA repair genes BRCA1, GSTP1 and MGMT in breast cancer samples of Chinese women. Methods: Using methylation speci fi c PCR (MSP), we analyzed the methylation status of 3 DNA repair genes BRCA1, GSTP1 and MGMT in 106 paired breast tumors and corresponding normal tissues. Results: The methylation rates of BRCA1, GSTP1 and MGMT were 24.5% (26/106), 29.2% (31/106) and 18.9% (20/106) in breast cancer tissues, which were higher than those (7.5%, 11.3% and 4.7%) in paired normal breast tissues, respectively (P＜0.01). Methylation in at least one of the genes was found in 50.9% (54/106) of the breast cancer and 19.8% (21/106) in paired normal breast tissues. And the mean number of genes hypermethylated in each tumor and paired normal breast tissues were 0.73 and 0.24, respectively (P＜0.000 1). The methylation status of BRCA1 was more frequent in the younger patients than in the older patients (P=0.007) and most BRCA1 methylated patients were ER negative (P=0.020). Methylation status of GSTP1 was signi fi cantly correlated with tumor size, lymph node metastasis (P=0.028 and 0.033, respectively). MGMT methylation was significantly correlated with tumor stage, higher tumorgrade and lymph node metastasis (P=0.016, 0.025 and 0.030, respectively). High frequency simultaneous methylation of these 3 genes was more often in those with higher tumor stage and lymph node metastasis (P=0.028 and 0.007, respectively). Conclusion: Hypermethylation of BRCA1, GSTP1 and MGMT genes may be linked to various known clinicopathological features of breast cancer in Chinese women, and the increasing multiple gene methylation in tumors may indicate an aggressive phenotype for breast cancer. Detection of the methylation status of these genes may be useful for identifying patients at high risk for breast cancer.

Breast cancer; DNA methylation; MSP

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.07.002

R737.9

A

1007-3639(2014)07-0487-06

2014-03-27

2014-05-28）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No：81172508)。

符德元 E-mail:fdy1003@163.com