河南省新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院婦科婦瘤科，河南 新鄉(xiāng) 453000

Aurora-B在宮頸癌組織中的表達(dá)與其靶向抑制劑ZM447439增強紫杉醇化療作用的基礎(chǔ)研究

劉國燕 李君 李力 郭祥翠

河南省新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院婦科婦瘤科，河南 新鄉(xiāng) 453000

背景與目的：Aurora激酶是調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂過程的重要激酶，其在眾多腫瘤中呈過度表達(dá)，該激酶也就成為新的腫瘤治療靶點之一。本研究旨在探討Aurora-B蛋白在宮頸癌中表達(dá)及其與宮頸癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，同時研究Aurora-B靶向抑制劑增強紫杉醇對宮頸癌細(xì)胞株SiHa化療的作用。方法：應(yīng)用免疫組化法分析70例宮頸癌、46例CINⅡ和21例正常宮頸病理切片。應(yīng)用MTT法檢測了ZM447439、紫杉醇對宮頸癌細(xì)胞株的增殖抑制試驗。并且通過Western blot分析了SiHa細(xì)胞在ZM447439處理后凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果：發(fā)現(xiàn)宮頸癌中Aurora-B蛋白高表達(dá)(50/70，71.43%)，在鱗癌中高表達(dá)(42/50，84%)，并且與細(xì)胞分化程度相關(guān)(P=0.000 3)。ZM447439作用于SiHa細(xì)胞株后有明確的隨時間和劑量相關(guān)的增殖抑制，并且ZM447439可以對紫杉醇有明確的化療協(xié)同作用(Q＞1.15)。經(jīng)Western blot證實ZM447439通過升高P53水平促進SiHa細(xì)胞凋亡。結(jié)論：宮頸癌中Aurora-B蛋白高表達(dá)，靶向Aurora-B的ZM447439可以協(xié)同增強紫杉醇對宮頸細(xì)胞株抑制作用。

宮頸腫瘤；Aurora-B；靶向治療；紫杉醇

晚期宮頸癌和復(fù)發(fā)性宮頸癌預(yù)后差，目前對這部分的患者主要是藥物治療聯(lián)合放療或姑息性手術(shù)治療，藥物化療的毒性和腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性、化療耐藥是目前治療的主要問題［1］。尋找有效的化療藥物或化療方案、減輕化療毒性是提高該類患者療效的關(guān)鍵之一，尋找宮頸癌發(fā)病機制中新的治療靶點是目前廣大婦科腫瘤醫(yī)師的主要研究方向。作為哺乳動物細(xì)胞Aurora激酶家族成員之一，Aurora-B是染色體的過客蛋白，對于染色體的正確排列和分離有著非常重要的作用，Aurora-B激酶被抑制導(dǎo)致染色體濃縮被抑制，阻礙細(xì)胞進入有絲分裂［2］。研究發(fā)現(xiàn)Aurora-B在許多腫瘤中存在過表達(dá)，抑制其表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、促進細(xì)胞凋亡［3-4］。本研究探討Aurora-B在宮頸癌中表達(dá)，并研究Aurora-B靶向抑制劑協(xié)同紫杉醇對宮頸癌細(xì)胞株化療作用。

1 資料和方法

1.1 組織標(biāo)本和細(xì)胞株

收集2011年1月—2011年12月在我院手術(shù)后保存的病理蠟塊，其中宮頸癌(廣泛全子宮+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù))70例，CIN Ⅱ(宮頸錐切術(shù))46例，正常宮頸(子宮肌瘤手術(shù))21例。所有患者資料隨訪2年。SiHa細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 儀器、試劑與方法

兔多克隆抗Aurora-B抗體(美國Santa cruz公司)；SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德公司)，所有免疫組化試驗按照博士德公司提供的說明進行。免疫組化結(jié)果由1名高年資病理醫(yī)師判讀，判讀標(biāo)準(zhǔn)：每張片子隨機選用3個腫瘤高倍視野，按照陽性細(xì)胞的百分比分為4組：沒有陽性染色的為陰性；＜10%的陽性細(xì)胞染色為弱陽性(1+)；10%～30%陽性細(xì)胞染色為中等強度陽性(2+)，＞30%的細(xì)胞陽性染色為強陽性染色(3+)。

細(xì)胞株用中科院上海細(xì)胞庫推薦的培養(yǎng)基加10%胎牛血清培養(yǎng)，傳代時用0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例傳代。ZM447439購自美國Selleck公司，紫杉醇購自揚子江藥業(yè)有限公司，MTT購自美國Sigma公司。細(xì)胞藥物敏感性試驗用MTT法，將處于對數(shù)生長期的人宮頸癌細(xì)胞制成1×104/mL的細(xì)胞懸液，每孔200 μL，加至96孔培養(yǎng)板。實驗設(shè)藥物處理組、空白對照組(每組設(shè)5個復(fù)孔)，ZM447439處理組的濃度分別為：62.5、125、250、500、1 000、2 000 nmol/L置37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加MTT (5 m/mL)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去上清液，每孔加150 μL DMSO，在微量振蕩器上振蕩10 min，靜置10 min，然后經(jīng)自動酶標(biāo)讀數(shù)儀測定A490值。藥物作用效應(yīng)即抑制率 (fa)=(1-試驗組平均A值/腫瘤細(xì)胞對照組平均A值)×100%。

ZM447439聯(lián)合紫杉醇對宮頸癌細(xì)胞株的化療協(xié)同試驗，按照前述的MTT法接種細(xì)胞于96孔板，紫杉醇處理組的濃度分別為：2、4、8、16 nmol/L。ZM447439與紫杉醇聯(lián)合作用：采用細(xì)胞毒性約為10%的低濃度ZM44743962，5 nmol/L與紫杉醇2、4、8、16 nmol/L聯(lián)用，按前述方法培養(yǎng)72 h，測定A490值，計算抑制率。按金氏公式(Q=Ea+b/Ea+Eb-Ea×Eb)評價2種藥物合用是否有協(xié)同或拮抗作用，公式中Ea+b為聯(lián)合用藥時腫瘤細(xì)胞增殖抑制率，Ea、Eb分別為A藥、B藥單獨用藥時的抑制率。若Q值在0.85～1.15范圍內(nèi)為2藥合用單純相加，Q值＞1.15為增強，Q值＜0.85則表示2藥合用有拮抗作用［5］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。計數(shù)資料采用χ2檢驗；計量資料采用非參數(shù)檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Aurora-B在不同宮頸組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示Aurora-B蛋白的表達(dá)定位于細(xì)胞核，為棕褐色顆粒，70例宮頸癌中50例陽性染色，陽性率71.43%；46例CIN中10例陽性，陽性率21.74%，21例正常宮頸無陽性表達(dá)，組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 Aurora-B表達(dá)與宮頸癌的臨床病理特征相關(guān)性分析

在70例宮頸癌患者中經(jīng)免疫組化檢測Aurora-B蛋白的表達(dá)結(jié)果與臨床病理特征相關(guān)性分析如下：年齡不影響Aurora-B蛋白的表達(dá)，年齡≥40歲陽性率71%(32/45)，年齡＜40歲陽性率72%(18/25)，2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在病理類型方面，鱗癌Aurora-B蛋白表達(dá)陽性率高于腺癌病例，鱗癌陽性率84%(42/50)，腺癌陽性率40%(8/20)，2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)。在組織分化上，腫瘤分化與Aurora-B蛋白的表達(dá)有相關(guān)性，分化G1、G2、G3的陽性率分別為38%(10/26)、83.3%(20/24)、100%(20/20)，3組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000 3)。在FIGO分期方面，ⅠA、ⅠB、ⅡA、ⅡB的陽性率分別為70%(2/5)、73.9%(17/23)、76.7%(23/30)、50%(6/12)，各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.167)。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性率為69%(11/16)，淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組的陽性率為72%(39/54)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.736)。在脈管浸潤方面，脈管浸潤組陽性率為76.2%(16/21)，無脈管浸潤組陽性率為67.3%(33/49)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.213)。

2.3 ZM447439和紫杉醇對宮頸癌細(xì)胞株增殖抑制影響

ZM447439和紫杉醇對宮頸癌細(xì)胞株增殖抑制影響具體見圖1和圖2，由此可見ZM447439對SiHa細(xì)胞株的增殖抑制呈時間和劑量依賴性。

2.4 ZM447439和紫杉醇聯(lián)合作用SiHa細(xì)胞的協(xié)同作用

ZM447439和紫杉醇聯(lián)合作用SiHa細(xì)胞72 h后細(xì)胞抑制率大于單獨用藥，在ZM447439 62.5 nmol/L(IC10，10%抑制率濃度)、125 nmol/ L(IC20，20%抑制率濃度)下紫杉醇作用于SiHa細(xì)胞有較強的協(xié)同增強化療作用(Q＞1.15)。因為在ZM447439濃度為125 nmol/L下加用紫杉醇的濃度高于6 nmol/L是大部分細(xì)胞基本死亡漂浮，不能進行MTT檢測。從結(jié)果看加用ZM447439后紫杉醇對細(xì)胞株抑制率明顯增加，Q值均＞1.15為抑制增強作用(表1)。

2.5 ZM447439對SiHa細(xì)胞株中P53、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

在6孔板中每孔種6×104個細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后分別加入ZM447439(1 μmol/L)、紫杉醇(4 nmol/L)和2者聯(lián)合用藥，用藥24 h后收集細(xì)胞，細(xì)胞裂解后進行Western blot檢測Aurora-B、P53、Bcl-2蛋白的表達(dá)。如圖3所示。在ZM447439處理后，Aurora-B表達(dá)減少，P53水平升高，抗細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2有輕度下降。

3 討 論

Aurora激酶作為有絲分裂調(diào)節(jié)者家族之一，近年來受到生物學(xué)家的廣泛重視，尤其是Aurora-A被認(rèn)為是在許多腫瘤中過表達(dá)，被認(rèn)為是腫瘤惡變過程中關(guān)鍵過程之一［6］。隨著人們對Aurora激酶家族的深入研究，現(xiàn)在人們發(fā)現(xiàn)Aurora-B雖然是細(xì)胞染色體的過客蛋白，對于染色體的正確排列和分離有著非常重要的作用，進一步的研究發(fā)現(xiàn)在許多腫瘤中均有Aurora-B的過表達(dá)，并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［7］。所以Aurora激酶日益成為腫瘤治療研究的靶點。本研究在分析70例宮頸癌組織發(fā)現(xiàn)，Aurora-B在宮頸癌中呈過表達(dá)，并且與腫瘤的分化程度相關(guān)，另外鱗癌較腺癌有更高的陽性率。由于本組資料隨訪時間僅2年左右，故本研究未進一步分析Aurora-B與宮頸癌預(yù)后和復(fù)發(fā)的相關(guān)性?，F(xiàn)有的資料提示Aurora-B的表達(dá)與宮頸癌的預(yù)后無關(guān)，但可能是宮頸癌發(fā)生進程中重要步驟之一［8］。

ZM447439是一種選擇性的ATP競爭性Aurora B抑制劑，它可以選擇性抑制Aurora B及其下游目的蛋白H3的磷酸化，從而可以抑制染色體排列、紡錘體檢查點功能和胞質(zhì)的分裂［9］。Girdler等［10］通過RNA干擾和誘導(dǎo)突變等技術(shù)研究證實ZM447439引起腫瘤細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)行為的改變是通過抑制Aurora-B活性所致。本研究選用宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞株在ZM447439作用24、48、72 h后細(xì)胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)隨著ZM447439濃度的升高細(xì)胞抑制率逐漸上升，在相同濃度下隨著時間的延長，細(xì)胞抑制率也是逐漸增加，與紫杉醇有相似的細(xì)胞抑制作用。由此可見ZM447439作為宮頸癌治療藥物的具有進一步研究的潛在治療價值。

我們?yōu)檫M一步探討ZM447439與紫杉醇的化療作用，我們應(yīng)用ZM447439抑制率為10%左右的濃度62.5 nmol/L為基準(zhǔn)添加計量，分析了紫杉醇在2、4、6、8、16 nmol/L濃度下對SiHa細(xì)胞的抑制率發(fā)現(xiàn)，按照金氏公式計算出協(xié)同作用的Q值，均大于1.15，說明ZM447439可以協(xié)同增強紫杉醇的化療作用，為今后ZM447439應(yīng)用于臨床后聯(lián)合化療提供了新的理論支持。

在分析ZM447439作用于SiHa細(xì)胞后，我們發(fā)現(xiàn)ZM447439可以導(dǎo)致P53的水平升高，細(xì)胞凋亡增加，減弱了Bcl-2的抗凋亡作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。這與文獻報道的ZM447439作用機制相同［11］。ZM447439同時具有靶向抑制Aurora-a的抑制作用，在高濃度下同時具有抑制MEK1、Src的作用［9］，而這些蛋白都是腫瘤細(xì)胞中關(guān)鍵的步驟之一，并且抑制Aurora后與提高腫瘤的放療敏感性相關(guān)［12］，由此可見ZM447439具有廣泛的臨床應(yīng)用前景，但是還需要進一步的臨床試驗驗證。

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Basic study on Aurora-B expression in cervical cancer and targeted inhibitor ZM447439 enhances paclitaxel anti-tumor activity in cervical cancer

LIU Guo-yan, LI Jun, LI Li, GUO Xiang-cui

(Department of gynecological, department of gynecological tumor, Xinxiang Central Hospital in Henan Province, Xinxiang Henan 453000, China)

LIU Guo-yan E-mail: lgy8280@163.com

Background and purpose: Aurora kinases, frequently detected to be over-expressed in some human tumors, regulate many essential events during tumor cell mitosis progression and have been regarded as potentially important targets for cancer therapy. This study was designed to detect Aurora-B expression in cervical carcinoma, explore the relation Aurora-B expression and clinicopathologic feature. So, Aurora-B kinase inhibition ZM447439 was used to investigate the effect of ZM447439 on SiHa cell line and the synergy effect with paclitaxel. Methods: Detected Aurora-B protein in cervical carcinoma(70 patients), CINⅡ(46 patients) and normal cervix(21patients) by immunohistochemistry. The inhibitory effects of ZM447439 and paclitaxel in SiHa cell line were investigated by MTT based assay, The expression of apoptosis associated protein was measured by Western blot. Results: The rate of Aurora-B expression is 71.43% in cervical cancer, with no signi fi cant correlation to clinical stage, age, lymph node metastasis, vascular invasion (P＞0.05). Aurora-A protein expression has significant correlation to pathological type and grade(P＜0.05). Enhanced antiproliferative effects were found when SiHa cells were cultured with ZM447439. Synergic effect of ZM447439 combined with paclitaxel was found in SiHa cell line(Q＞1.15). The level of P53 was increased significantly through ZM447439 treatments with Western blot. Conclusion: Our data provides strong evidence that high expression of Aurora-B in cervical cancer. The targeted Aurora-B inhibitors, ZM447439, can enhance paclitaxel anti-tumor activity in cervical cancer.

Cervical carcinoma, Aurora-B, Targeted therapy, Paclitaxel

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.07.013

R737.33

A

1007-3639(2014)07-0545-05

2014-03-28

2014-06-06）

劉國燕 E-mail:lgy8280@163.com