GATA5甲基化在結(jié)直腸癌血漿和糞便中的檢測及臨床診斷價(jià)值

張學(xué)松張謝黃詩良陸宏娜王丹萍黃志剛

1.浙江省寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院消化內(nèi)科，浙江 寧波 315040；2.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 寧波315211

GATA5甲基化在結(jié)直腸癌血漿和糞便中的檢測及臨床診斷價(jià)值

張學(xué)松1張謝1黃詩良1陸宏娜1王丹萍2黃志剛1

1.浙江省寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院消化內(nèi)科，浙江 寧波 315040；2.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 寧波315211

背景與目的：結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是全球發(fā)病率第三，死亡率第四的惡性腫瘤。遺傳學(xué)及表觀遺傳學(xué)的改變引發(fā)抑癌基因甲基化表達(dá)沉默是CRC發(fā)生的重要原因，本研究旨在探討血漿、糞便GATA5啟動(dòng)子甲基化檢測在CRC臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法：收集34例健康體檢者和43例CRC患者的血漿和配對的糞便標(biāo)本。采用甲基化特異性PCR法(methylation specific PCR method，MSP)檢測其血漿、糞便中GATA5甲基化水平，并分析其與臨床病理特征相關(guān)性。結(jié)果：MSP結(jié)果顯示CRC患者血漿、糞便中GATA5啟動(dòng)子甲基化率(60.74%、76.60%)高于健康者發(fā)生率(26.47%、32.35%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.006 7，0.000 2)。CRC患者血漿甲基化發(fā)生率與臨床分期(P=0.000 5)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.020)密切相關(guān)，而糞便GATA5甲基化水平與臨床病理特征無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：檢測糞便GATA5甲基化水平并輔以血漿GATA5甲基化水平可作為一種簡單、非侵入、敏感及特異的方法應(yīng)用于CRC患者的臨床診斷。

GATA5；結(jié)直腸癌；甲基化特異性PCR；甲基化

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是一種常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率都非常高［1］。CRC由于早期癥狀缺乏或不典型，就診時(shí)往往已為進(jìn)展期腫瘤，且CRC患者生存率與其分期密切相關(guān)，Ⅰ期與Ⅳ期5年的生存率分別為93%和8%［2］。早期發(fā)現(xiàn)早期治療是提高CRC患者存活率唯一途徑。目前結(jié)腸鏡檢查是診斷CRC的金標(biāo)準(zhǔn)，但其不適用于普通人群篩查，故尋求更為方便和敏感的非侵入性腫瘤標(biāo)記物成為研究的熱點(diǎn)。

表觀遺傳基因沉默已被認(rèn)為在腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用，基因啟動(dòng)子異常甲基化導(dǎo)致基因沉默乃至腫瘤發(fā)生［3-5］。結(jié)腸癌中諸多基因存在高甲基化現(xiàn)象，啟動(dòng)子甲基化常發(fā)生在CRC癌變過程的極早期［6-8］。最近研究顯示結(jié)腸腫瘤患者血液、糞便可檢測出DNA高甲基化，為結(jié)直腸腫瘤非侵入性篩查手段提供了可能［6,8-11］。

GATA5作為轉(zhuǎn)錄因子GATA家族的一員，在胚胎發(fā)育時(shí)期能促進(jìn)胃腸道的正常發(fā)育，并有助腸上皮細(xì)胞分化［12-13］。前期研究發(fā)現(xiàn)GATA5在胃腸道細(xì)胞系及其腫瘤組織中沉默表達(dá)［14］。但是國內(nèi)外鮮見報(bào)道同時(shí)檢測CRC患者血液和糞便中GATA5的甲基化水平研究。本研究應(yīng)用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(metilylation specific PCR，MSP)法首次同時(shí)檢測CRC患者血漿、糞便中GATA5啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)水平，并結(jié)合其患者一般資料、臨床病理學(xué)特征來探討GATA5基因甲基化在CRC發(fā)生、發(fā)展中的作用，以期為結(jié)直腸腫瘤篩查提供一個(gè)新的腫瘤標(biāo)志物。

1 資料和方法

1.1 臨床資料及標(biāo)本采集

收集浙江省寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院2012 年10月—2013 年6 月胃小腸外科收治的43例CRC患者的血漿及對應(yīng)糞便標(biāo)本，男性13例，女性30例，平均年齡(59.2±1.7)歲。入選條件：⑴患者均經(jīng)過結(jié)直腸鏡活檢確診；⑵患者未經(jīng)任何放、化療治療；⑶無其他腫瘤病史。全部病例均按WHO 標(biāo)準(zhǔn)和國際抗癌聯(lián)盟TNM系統(tǒng)進(jìn)行組織病理分型。另收集34例體檢無殊正常健康者的血漿及對應(yīng)糞便標(biāo)本作為對照，男性21 例，女性13 例，平均年齡(61.1±2.3)歲。于患者手術(shù)前采集其周圍靜脈血液標(biāo)本3 mL，置于乙二胺四乙酸鈉處理過的抗凝管中，3 000×g 離心15 min，離心取上清液，置于-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。糞便收集為患者前5天內(nèi)未進(jìn)行任何侵入性操作，包括結(jié)腸鏡檢查、灌腸等，置于-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 血漿DNA提取

取上述采樣血漿標(biāo)本，每份樣本取400 μL血漿，按QIAmp DNA Blood Mini Kit(Qiagen)試劑盒說明書進(jìn)行DNA 提取，最終以80 μL AE洗脫液洗脫，存于-20℃冰箱備用。

1.3 糞便DNA提取

稱取上述糞便樣本200 mg左右，QIAamp DNA Fecal Mini kit(Qiagen)試劑盒說明書進(jìn)行DNA 提取，最終以100 μL洗脫液洗脫，存于-20℃冰箱備用。

1.4 血漿和糞便DNA修飾

分別取血漿和糞便樣品DNA 2 μg，按照EpiTect Bisulfite Kit(Qiagen)說明書進(jìn)行。經(jīng)亞硫酸鹽處理后DNA 中未甲基化的胞嘧啶(C) 轉(zhuǎn)變成尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶則保持不變，修飾后的DNA用30 μL EB重新溶解，用于MSP檢測。

1.5 MSP檢測

設(shè)計(jì)MSP引物，引物序列見表1。PCR 反應(yīng)體系總體積為50 μL ：2 μL DNA 樣品，10 μL 緩沖液(美國KAPA BIO公司)，1 μL 10 mmol/L dNTP(美國KAPA BIO公司) , 1 μL上下引物 (l50 mmol/L)，0.5 U Taq 酶(美國KAPA BIO公司)。

擴(kuò)增條件：9 5 ℃預(yù)變性5 m i n；9 5 ℃變性3 0 s，T m+8 ℃(T m為退火溫度)退火30 s，72 ℃延伸1 min，共10個(gè)循環(huán)；95 ℃變性30 s，Tm ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共38個(gè)循環(huán)；最后，72 ℃延伸7 min。

PCR 擴(kuò)增結(jié)束后，將產(chǎn)物置于2.5%瓊脂糖凝膠(含溴化乙啶0.5 μg/mL)鑒定，每孔加樣量為10 μL，電泳緩沖液為1×TAE。電泳結(jié)束后，紫外檢測儀下觀察并拍照。甲基化判定：PCR產(chǎn)物出現(xiàn)甲基化條帶，而不出現(xiàn)非甲基化條帶的樣品，判定為甲基化；出現(xiàn)未甲基化條帶，而不出現(xiàn)甲基化條帶的樣品，判定為未甲基化；甲基化條帶和未甲基化條帶均出現(xiàn)的樣品，判定為甲基化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血漿、糞便GATA5甲基化表達(dá)

MSP結(jié)果顯示正常健康者、CRC患者血漿標(biāo)本GATA5啟動(dòng)子甲基化發(fā)生率分別為26.47%(9/34)，60.74%(26/43)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006 7)；正常健康者、CRC患者糞便標(biāo)本GATA5啟動(dòng)子甲基化發(fā)生率分別為32.35%(11/34)，76.60%(36/43)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.000 1)(圖1、2)。

2.2 結(jié)直腸癌患者血漿、糞便GATA5甲基化與臨床病理特征相關(guān)性

結(jié)直腸癌糞便GATA5甲基化發(fā)生率與性別(P=1)、年齡(P=0.391)、位置(P=0.077)、腫瘤大小(P=0.314)、腫瘤個(gè)數(shù)(P=1)、分化(P=0.396)、分期(P=0.240)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.412)，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(表2)。結(jié)直腸癌血漿GATA5甲基化發(fā)生率與性別(P=0.187)、年齡(P=0.207)、位置(P=0.071)、腫瘤大小(P=0.445)、腫瘤個(gè)數(shù)(P=0.665)、分化(P=0.343)無密切相關(guān)，與分期(P=0.000 5)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.020)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

2.3 血漿、糞便GATA5甲基化診斷CRC效能

血漿GATA5 DNA甲基化檢測CRC的靈敏度和特異度分別為60.47%(95%CI:44.41%～75.02%)，70.59%(95%CI:52.52%～84.90%) (P=0.0067)；而糞便GATA5 DNA檢測CRC的靈敏度和特異度分別為83.72%(95%CI:69.30%～93.19%)，67.65%(95%CI:49.47%～82.61%) (P＜0.000 1，表3)；正常健康者和CRC患者中，血漿或糞便能檢測到GATA5甲基化的靈敏度和特異度分別為88.37%(95%CI:74.92%～96.11%)，55.88%(95%CI:37.89%～72.82%) (P＜0.000 1)。正常健康者和CRC患者中，血漿和糞便都能檢測到GATA5甲基化的靈敏度和特異度分別為55.81%(95%CI:39.88%～70.92%)，85.29%(95%CI:68.94%～95.05%)(P=0.000 2，表3)。

3 討 論

1993年Mandel最早提出對普通人群的結(jié)直腸癌篩查可顯著降低結(jié)直腸癌死亡率［15］。目前主要用于普查篩選的方法包括二大類：糞便檢查和影像學(xué)檢查。FOB法雖簡單方便，但存在靈敏度很低，假陽性率高［16］。結(jié)腸鏡檢查存在需清潔灌腸、痛苦、檢查時(shí)間較長、有一定并發(fā)癥的缺點(diǎn)，作為普查項(xiàng)目，患者不容易接受。尋找更為簡便靈敏度特異度高的CRC非侵入性腫瘤標(biāo)志物是目前研究熱點(diǎn)。

GATA1-6是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的家族，與胚胎組織的干細(xì)胞分化密切相關(guān)［17］。GATA5主要作用于成人腸上皮細(xì)胞分化［13］。目前研究顯示GATA5甲基化常發(fā)生在人類腫瘤中，比如胃癌、腸癌、子宮癌等［18-19］；研究也顯示在人類不同腫瘤細(xì)胞株中，GATA5甲基化沉默表達(dá)，暗示其與致癌作用密切相關(guān)［13-14,19］。但是本課題組前期發(fā)現(xiàn)胃癌血漿和糞便中GATA5甲基化率非常低，但是在CRC血漿和糞便中甲基化程度非常高。Hellebrekers研究發(fā)現(xiàn)在CRC組織中，GATA5甲基化率為79.22%(61/77)，癌旁組織甲基化率為13%(13/100)［20］。本研究發(fā)現(xiàn)正常健康者血漿、糞便標(biāo)本GATA5啟動(dòng)子甲基化發(fā)生率分別為26.47%(9/34)，32.35%(11/34)；CRC患者血漿、糞便標(biāo)本GATA5啟動(dòng)子甲基化發(fā)生率分別為60.74%(26/43)，76.60%(36/43)。說明GATA5血漿和糞便靈敏度和特異度略低于組織，但也有較高的臨床診斷價(jià)值。CRC患者血漿GATA5甲基化與分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示隨著CRC發(fā)展，GATA5甲基化程度升高，可能與其預(yù)后有關(guān)。但是糞便GATA5甲基化水平與其臨床病理特征無相關(guān)性，可能是其CRC甲基化程度高，樣本量少，雖有此趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這需要我們收集更多的樣品進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

本研究結(jié)果顯示C R C患者糞便和血漿G A T A 5聯(lián)合檢測，靈敏度為88.37%(74.92%～96.11%)，特異度為55.88% (37.89%～72.82%)，優(yōu)勢比(Odds ratio，OR)為9.63(3.04～30.48)。而單獨(dú)檢測糞便GATA5的OR值最高為10.75(3.64～31.75)，靈敏度雖低于聯(lián)合檢測，但是特異度有所提高。糞便DNA檢測是通過檢測脫落到腸腔的腫瘤細(xì)胞異常DNA發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸腫瘤，研究顯示腺瘤和腺癌細(xì)胞可連續(xù)性脫落到腸腔，這些細(xì)胞的DNA在糞便中相對穩(wěn)定，可以與細(xì)菌DNA分離鑒別［21］。研究結(jié)果提示檢測糞便中GATA5甲基化有助于CRC患者的篩查，輔以血漿檢測，可以提高其檢測靈敏度。

以上結(jié)果顯示，從基因甲基化入手尋找特異的腫瘤標(biāo)志物, 對于CRC早期診斷有著積極的意義。本研究結(jié)果表明，利用MSP進(jìn)行的糞便、血漿標(biāo)本GATA5甲基化分析，作為一種微創(chuàng)的檢測方法在臨床診斷中有潛在的應(yīng)用價(jià)值，有可能成為一種新的輔助CRC診斷的分子生物學(xué)指標(biāo)。本次實(shí)驗(yàn)收集的樣本還不夠，我們將進(jìn)一步收集更多的CRC標(biāo)本，進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。本次實(shí)驗(yàn)應(yīng)用MSP檢測用的是定量方法，接下來我們會(huì)根據(jù)前期得到是實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對GATA5進(jìn)行焦磷酸測序，進(jìn)一步驗(yàn)證GATA5作為CRC非侵入性微創(chuàng)檢測方法在臨床應(yīng)用中的可行性和可信性。下一步我們會(huì)跟蹤這些患者5年生存率，并定期收集這些患者的血液、糞便，進(jìn)一步探討GATA5對CRC預(yù)后的臨床價(jià)值和意義。

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Detection of GATA5 gene methylation in plasma and stool of colorectal cancer and the clinical diagnosis

ZHANG Xue-song1, ZHANG Xie1, HUANG Shi-liang1, LU Hong-na1, Wang Dan-ping2, Huang

Zhi-gang1
(1.Department of Gastroenterology, Ningbo Medical Treatment Center Li Huili Hospital, Ningbo Zhejiang 315040, China; 2.School of Medicine, Ningbo University, Ningbo Zhejiang 315211, China)

Huang Zhi-gang E-mail: Huangzg@foxmail.com

Background and purpose: Colorectal cancer (CRC) is a malignancy which is the third incidence and the fourth mortality in the worldwide. The main reason for the development of CRC is that the changes of genetic and epigenetic causes the tumor suppressor gene methylation silencing. This study aimed to investigate the plasma and stool GATA5 gene promoter methylation was detected in clinical diagnosis of CRC. Methods: To collect the paired plasma and stool specimens of 34 cases of healthy and 43 cases of patients with CRC. Methylation speci fi c PCR (MSP) was respectively detected the GATA5 gene methylation levels of GATA5 gene in plasma and stool. And then separately analyzed their correlations with clinical and pathological parameters in gastric carcinoma. Results: The result of MSP showed that GATA5 gene promoter methylation rates in plasma and stool of CRC patients were 60.74%, 76.60%, respectively, were higher than those of healthy persons (6.47%, 32.35%). And the differences were statistically signi fi cant (P=0.006 7, P=0.000 2, respectively). GATA5 gene methylation rates in plasma of CRC patients were closely related to clinical stage (P=0.000 5) and lymph node metastasis(P=0.020), while GATA5 gene methylation rates in stool of CRC patients had no signi fi cant with clinical and pathological parameters. Conclusion: Detection of faecal GATA5 gene methylation level and supplemented plasma GATA5 gene methylation level can become a simple, non-invasive, sensitive and speci fi c method for clinical diagnosis of CRC.

GATA5 gene; Colorectal cancer; Methylation speci fi c PCR; Methylation

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.07.004

R735.3

A

1007-3639(2014)07-0501-06

2014-04-22

2014-05-23）

寧波市社會(huì)發(fā)展基金項(xiàng)目(No：2011C50022)；寧波市科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(No: 2013B82010)。

黃志剛 E-mail:Huangzg@foxmail.com