江西省南昌市第三醫(yī)院乳腺科，江西 南昌 330009

miR-340對乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞增殖和凋亡的影響

歐陽倩雯 曹亞麗

江西省南昌市第三醫(yī)院乳腺科，江西 南昌 330009

背景與目的：既往研究表明，微小RNA-340(miR-340)能負(fù)性調(diào)控多種腫瘤的進(jìn)展，但其在乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡中的研究較少，本研究旨在探討miR-340對乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞增殖和凋亡的作用。方法：利用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將pre-miR-340或anti-miR-340瞬時轉(zhuǎn)染至乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞，通過RT-PCR檢測miR-340 mRNA的水平，蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)，MTT比色法檢測細(xì)胞增殖的抑制情況，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果：Pre-miR-340增加了MDA-MB231細(xì)胞中miR-340表達(dá)，同時增加cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)、抑制MDA-MB231細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。而anti-miR-340抑制了MDAMB231細(xì)胞中miR-340表達(dá)，并且抑制cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)，促進(jìn)了MDA-MB231細(xì)胞增殖，抑制了MDAMB231細(xì)胞的凋亡。結(jié)論：miR-340轉(zhuǎn)染后能上調(diào)MDA-MB231細(xì)胞中cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)從而抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。

乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞；miR-340；增殖；凋亡

乳腺癌的高侵襲和轉(zhuǎn)移能力是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因，而癌細(xì)胞增殖快和凋亡減少是其侵襲和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一類廣泛存在于真核細(xì)胞中長約22個核苷酸(nt)的單鏈、非蛋白編碼RNA，通過與靶基因互補(bǔ)位點(diǎn)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平而調(diào)控靶基因的表達(dá)和翻譯，在細(xì)胞生理活動中有重要作用［1］。在腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，miR發(fā)揮類似于癌基因或抑癌基因的作用，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和細(xì)胞凋亡過程［2-3］。研究表明，微小RNA-340(miR-340)在乳腺癌組織中表達(dá)減少［4］，并且能夠抑制MDAMB231的侵襲和轉(zhuǎn)移［5］。本研究進(jìn)一步探索miR-340在MDA-MB231細(xì)胞凋亡中的調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 材料

人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB23l為本室保存。pre-miR-340或anti-miR-340及無關(guān)序列由上海吉瑪公司合成。Hairpin-itTMmiRNAs real-time PCR Quantization Kit購自上海吉瑪公司。轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體LipofectamineTM2000、凋亡檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司；MTT購自美國Sigma公司；新生小牛血清購自杭州賽樂生物科技公司；caspase-3(ab49822)、β-actin (ab8226)抗體購自美國abcam公司；山羊抗體兔二抗(sc-2040)、山羊抗鼠二抗(sc-2039)購自美國Santa cruz公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

MDA-MB-23l細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度條件下培養(yǎng)。將人乳腺癌MDA-MB-23l細(xì)胞分別以每孔l×104、5×104、2×105接種到96、12、6孔板上。待細(xì)胞生長70%～80%時，按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，加入pre-miR-340或antimiR-340進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以無關(guān)序列作為空白對照。

1.3 Real-time PCR檢測法檢測miR-340的表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染后6 h收集細(xì)胞，抽提純化總RNA，按照Hairpin-itTMmiRNAs real-time PCR Quantization Kit 提供的說明書合成cDNA及進(jìn)行real-time PCR，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對結(jié)果進(jìn)行分析，利用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出檢測樣本miR-340 ct值。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測caspase-3蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染后24 h收集細(xì)胞，采用RIPA(美國Roche公司)裂解細(xì)胞，采用Bradford法對于蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。10%SDS-PAGE膠電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜，用5% BSA封閉1 h，一抗(caspase-3、β-actin抗體1∶1 000) 4 ℃溫育過夜，TBST漂洗，二抗(抗鼠和抗兔1∶10 000)室溫溫育1 h，TBST洗膜，采用美國Millipore公司熒光試劑盒顯色。

1.5 噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測細(xì)胞生長能力

每12 h檢測1個實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的存活率。具體方法如下：加5 mg/mL的MTT 20 μL于各孔中，培養(yǎng)4 h后小心吸去板中的培養(yǎng)液，各孔加150 μL DMSO，振動10 min后用酶標(biāo)儀(波長490 nm)測定各孔的A值，代表細(xì)胞的存活率，檢測2 d。

1.6 流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡變化

采用Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒，對經(jīng)轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞消化、預(yù)冷PBS清洗，先后用Annexin V-FITC結(jié)合和PI染色后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用One-way ANOVA方差分析法，首先利用Levene方法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，確定方差齊性且整體比較組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義后進(jìn)一步作多重比較，多重比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Real-time PCR檢測法檢測miR-340的表達(dá)水平

Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染premiR-340 到MDA-MB231細(xì)胞6 h后，miR-340表達(dá)水平明顯升高；而轉(zhuǎn)染anti-miR-340 到MDAMB231細(xì)胞6 h后, miR-340表達(dá)水平受到明顯抑制(圖1)。

2.2 Western blot檢測caspase-3蛋白表達(dá)

Western blot檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染premiR-340 到MDA-MB231細(xì)胞24 h后，cleavdcaspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高；而轉(zhuǎn)染antimiR-340 到MDA-MB231細(xì)胞24 h后，cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)水平受到明顯抑制(圖2)。

2.3 MTT法檢測細(xì)胞生長能力

細(xì)胞活力檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了premiR-340 到MDA-MB231細(xì)胞后，細(xì)胞生長受到明顯抑制；而轉(zhuǎn)染了anti-miR-340 到MDAMB231細(xì)胞后，細(xì)胞生長增快(圖3)。

2.4 細(xì)胞流式技術(shù)檢測MDA-MB231細(xì)胞凋亡

細(xì)胞流式技術(shù)凋亡檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了pre-miR-340 到MDA-MB231細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡明顯增加；而轉(zhuǎn)染了anti-miR-340 到MDAMB231細(xì)胞24 h后, 細(xì)胞凋亡減少(圖4)。

3 討 論

本研究運(yùn)用化學(xué)合成的非編碼miR-340前體pre-miR-340或干擾RNA anti- miR-340轉(zhuǎn)染MDA-MB231細(xì)胞，成功使MDA-MB231細(xì)胞中miR-340過表達(dá)或沉默，從而對MDA-MB231細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響。結(jié)果顯示，細(xì)胞中miR-340過表達(dá)，細(xì)胞凋亡增加；而抑制miR-340表達(dá)，細(xì)胞凋亡減少。

miR是一類含量豐富的非編碼蛋白小RNA。一般成熟miR的長度為21～24 nt，是由長度約為70 nt的具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的miR前體(pre-miR)經(jīng)過Dicer酶剪切后生成。miR能夠與靶向mRNA的3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)互補(bǔ)配對，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成或mRNA降解，從而實(shí)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄后水平上對目的基因或蛋白表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、增殖、分化和凋亡等基本的生理過程［1］。研究表明，在腫瘤組織中miR的表達(dá)水平表達(dá)存在異常［6-7］。而進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)miR可能發(fā)揮類似癌基因或抑癌基因的作用，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，如miR-17-92可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，被稱為“癌基因”［2］；Let-17可通過抑制癌基因或控制細(xì)胞分化和凋亡基因抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，被稱為“抑癌基因”［8］。

乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miR的表達(dá)水平失調(diào)可能是影響乳腺癌進(jìn)展的重要因素［9-11］。Wu等［4］研究表明，miR-340能夠抑制MDAMB231細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，并且乳腺癌患者組織中miR-340的表達(dá)水平是明顯下降的。在成神經(jīng)細(xì)胞瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-340可以誘導(dǎo)成神經(jīng)細(xì)胞瘤凋亡［12］。本研究中，通過上調(diào)miR-340能夠明顯抑制MDA-MB231細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡；而抑制MDA-MB231細(xì)胞中miR-340的水平后，細(xì)胞增殖加速，凋亡水平明顯下調(diào)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，miR-340可以調(diào)節(jié)凋亡蛋白酶caspase-3的活性。當(dāng)上調(diào)MDA-MB231細(xì)胞中miR-340的水平后，caspase-3的活性成分cleaved-caspas-3表達(dá)增加，細(xì)胞凋亡也增加；相反，當(dāng)用anti-miR-340抑制miR-340表達(dá)后，cleaved-caspas-3表達(dá)減少，細(xì)胞凋亡也相應(yīng)的降低。由此可以推測，miR-340通過調(diào)節(jié)caspase-3的活性來調(diào)控細(xì)胞凋亡的，這與Zhu等［12］的發(fā)現(xiàn)是一致的。總之，miR-340可以抑制MDA-MB231細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。

［1］ RUVKUN G. Molecular biology. Glimpses of a tiny RNA world［J］. Science, 2001, 294(5543): 797-799.

［2］ HAYASHITA Y, OSADA H, TATEMATSU Y, et al. A polycistronic microRNA cluster, miR-17-92, is overexpressed in human lung cancers and enhances cell proliferation［J］. Cancer Res, 2005, 65(21): 9628-9632.

［3］ 蔡飏, 陶莉, 譚越, 等. miR-125a增強(qiáng)多西他賽對乳腺癌生長的抑制作用［J］. 中國癌癥雜志, 2011, 21(10): 748-753.

［4］ 周鵬, 吳正升. miR-340在乳腺癌組織中的表達(dá)及意義［J］. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 48(6): 708-710.

［5］ WU Z S, WU Q, WANG C Q, et al. miR-340 inhibition of breast cancer cell migration and invasion through targeting of oncoprotein c-Met［J］. Cancer, 2011, 117(13): 2842-2852.

［6］ SETHI S, ALI S, SETHI S, et al. MicroRNAs in personalized cancer therapy［J］. Clin Genet, 2014, 86(1): 68-73.

［7］ CHDENG Q, YI B, WANG A, et al. Exploring and exploiting the fundamental role of microRNAs in tumor pathogenesis［J］. Onco Targets Ther, 2013, 6: 1675-1684.

［8］ TAKAMIZAWA J, KONISHI H, YANAGISAWA K, et al. Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperal［J］. Cancer Res, 2004, 64(11): 3753-3756.

［9］ IORIO M V, FERACIN M, LIU C G, et al. MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer［J］. Cancer Res, 2005, 65(16): 7065-7070.

［10］ YAN L X, HUANG X F, SHAO Q, et al. MicroRNA miR-21 overexpression in human breast cancer is associated with advanced clinical stage, lymph node metastasis and patient poor prognosis［J］. RNA, 2008, 14(11): 2348-2360.

［11］ KONDO N, TOYAMA T, SUGIURA H, et al. miR-206 Expression is down-regulated in estrogen receptor alphaposinetwork of epigenetically regulated microRNAs［J］. Oncogene, 2013, 32(24): 2927-2936.

［12］ ZHU X, WANG H, LIU F, et al. Identification of micro-RNA networks in end-stage heart failure because of dilated cardiomyopathy［J］. J Cell Mol Med, 2013, 17(9): 1173-1187.

The effect of miR-340 on proliferation and apoptosis of breast cancer cell MDA-MB231

OUYANG Qian-wen, CAO Ya-li
(Department of Breast Surgery, the Third Hospital of Nanchang, Nanchang Jiangxi 330009, China)

CAO Ya-li E-mail: 364590189@qq.com

Background and purpose: MicroRNA-340 (miR-340) has been demonstrated to play a role of negative regulation in many kinds of tumor, however, there are few reports about the relationship between miR-340 in proliferation and apoptosis of breast cancer cell. This study was aimed to explore the effect of miR-340 on proliferation and apoptosis of breast cancer cell MDA-MB231. Methods: The pre-miR-340 or anti-miR-340 were transiently transfected into breast cancer cell MDA-MB231 with LipofectamineTM2000. miR-340 level was detected by RT-PCR. The Western blot was performed to detect the protein level of cleaved-caspase-3. The inhibition rate of cell proliferation was evaluated by MTT assay. The cell apoptosis was studied by fl ow cytometry. Results: The pre-miR-340 facilitated the expression of miR-340 in MDA-MB231 cells. The pre-miR-340 enhanced the protein level of cleaved-caspase-3, inhibited the proliferation of MDA-MB231 cells and increased its apoptosis. On the contrary, the expression of miR-340 was inhibited by anti-miR-340 in MDA-MB231 cells. The protein level of cleaved-caspase-3 was reduced after the antimiR-340-transfected MDA-MB231 cells. Anti-miR-340 promoted the proliferation of MDA-MB231 cells. Decreased apoptosis of MDA-MB231 cells was observed by fl ow cytometry. Conclusion: The overexpression of miR-340 can effectively inhibit the proliferation and increase the apoptosis of MDA-MB231 cells, which may be explained by upregulating of protein cleaved-caspase-3 level.

Breast cancer cell MDA-MB231; miR-340; Proliferation; Apoptosis

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.07.007

R737.9

A

1007-3639(2014)07-0517-04

2014-03-28

2014-06-03）

曹亞麗 E-mail:364590189@qq.com