中國醫(yī)科大學(xué)附屬一院胸外科，遼寧 沈陽 110001

下調(diào)肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2/3復(fù)合體5對肺鱗癌細(xì)胞株SK-MES-1增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響

杜江 張林

中國醫(yī)科大學(xué)附屬一院胸外科，遼寧 沈陽 110001

背景與目的：肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2/3復(fù)合體5(actin related protein 2/3 complex subunit 5，ARPC5)參與肌動(dòng)蛋白的組裝，影響細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，在形成癌細(xì)胞侵襲性偽足的過程中起到重要作用。本研究通過基因沉默手段，探討下調(diào)ARPC5基因表達(dá)對肺鱗癌細(xì)胞株SK-MES-1增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。方法：應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法構(gòu)建ARPC5基因沉默(si-ARPC5)的SK-MES-1肺鱗癌細(xì)胞株，qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)鑒定轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)設(shè)置si-ARPC5實(shí)驗(yàn)組、空白對照組(mock組)及陰性對照組(NC組)。采用細(xì)胞技術(shù)試劑盒(cell couiting kit-8，CCK-8)法測定si-ARPC5對SK-MES-1細(xì)胞的增殖的影響；劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)測定si-ARPC5對SK-MES-1細(xì)胞遷移能力的影響；Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)測定si-ARPC5對SK-MES-1細(xì)胞的侵襲能力的影響。結(jié)果：轉(zhuǎn)染si-ARPC5后的SK-MES-1細(xì)胞在mRNA和蛋白水平上均下調(diào)ARPC5的表達(dá)。與mock組及NC組比較，si-ARPC5實(shí)驗(yàn)組SK-MES-1細(xì)胞增殖能力明顯下降(t=7.993，t=8.681，P＜0.05)。si-ARPC5實(shí)驗(yàn)組劃痕修復(fù)率(43.32±0.23)%，而mock組和NC組劃痕修復(fù)率分別為(73.11±0.43)%和(76.58±0.88)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.348，t=10.614，P＜0.05)。si-ARPC5組的SK-MES-1細(xì)胞穿膜數(shù)為(27±6)個(gè)，mock組為(101±11)個(gè)，NC組為(92±9)個(gè)。si-ARPC5組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于其他2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.229，t=8.391，P＜0.05)。結(jié)論：下調(diào)ARPC5基因的表達(dá)能夠顯著抑制肺鱗癌細(xì)胞株 SK-MES-1的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

肺鱗癌；肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2/3復(fù)合體5；增殖；遷移；侵襲

肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2/3復(fù)合體5(actin related protein 2/3 complex subunit 5，ARPC5)是肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2/3復(fù)合體(actin related protein 2/3 complex，ARP2/3)家族中的一員［1］。ARP2/3首先是在棘阿米巴中分離出來的，后來在酵母細(xì)胞及人類等脊椎動(dòng)物細(xì)胞中也分離得到這種復(fù)合體［2］。ARP2/3由Arp2、Arp3、ARPC1(p41-Arc)、ARPC2(p34-Arc)、ARPC3(p21-Arc)、ARPC4(p20-Arc)和ARPC5(p16-Arc)共7個(gè)亞單位組成［3-4］。ARP2/3復(fù)合體的主要功能是通過感應(yīng)細(xì)胞外調(diào)節(jié)信號(hào)活化肌動(dòng)蛋白纖絲并介導(dǎo)肌動(dòng)蛋白組裝，調(diào)控actin的聚合作用［5-7］；同時(shí)對于細(xì)胞樹突狀偽足和板狀偽足的形成起到重要作用［8］。Arp2、Arp3為肌動(dòng)蛋白actin提供成核位點(diǎn)，ARPC2和ARPC4是ARP2/3復(fù)合體的核心結(jié)構(gòu)，可以和肌動(dòng)蛋白纖絲結(jié)合［9-10］。ARPC1、3、5則通過與細(xì)胞外信號(hào)偶聯(lián)促進(jìn)肌動(dòng)蛋白纖絲活化及組裝［11］?？臻g結(jié)構(gòu)上ARPC5是相對分子質(zhì)量最小的成員，位于整個(gè)復(fù)合體最外，與Arp2、ARPC1和ARPC4相互作用，對維持ARP2/3復(fù)合體的結(jié)構(gòu)有著重要意義［1］。有研究表明，ARPC5能夠促進(jìn)正常細(xì)胞偽足的運(yùn)動(dòng)［12-13］。

惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制一直是腫瘤研究的重點(diǎn)。局部侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移很容易出現(xiàn)于肺癌患者的各個(gè)治療階段。一旦出現(xiàn)往往預(yù)后不佳，對于肺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究必要而緊迫。對于ARPC5在腫瘤形成發(fā)展中作用的研究尚處于起步階段，Wang等［14］在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在裸鼠原發(fā)乳腺腫瘤細(xì)胞中ARPC5基因表達(dá)上調(diào)。Moriya等［15］在研究肺鱗癌miRNA的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-133a明顯下調(diào)，而轉(zhuǎn)染miR-133a又能導(dǎo)致肺鱗癌細(xì)胞系中多種基因表達(dá)下調(diào)，其中明顯下調(diào)者中就包括ARPC5基因；并且發(fā)現(xiàn)ARPC5基因沉默能顯著降低肺癌細(xì)胞系P10細(xì)胞的增殖。之后，Kinoshita等［16］的實(shí)驗(yàn)表明ARPC5在多個(gè)頭頸部鱗癌細(xì)胞系中高表達(dá)，并能夠影響癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，ARPC5基因沉默可以導(dǎo)致癌細(xì)胞的形態(tài)由多角形改變?yōu)椴焕谇忠u轉(zhuǎn)移的圓形；并且在頭頸部鱗癌組織的mRNA和蛋白表達(dá)研究中均發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的ARPC5表達(dá)均高于癌旁正常組織。這些研究證明了ARPC5基因可能是一種新的癌基因。但是目前，對于ARPC5對腫瘤細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)能力影響的研究還很有限。本研究旨在通過基因沉默技術(shù)觀察ARPC5基因表達(dá)下調(diào)后對肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1增殖，遷移和侵襲的影響，探討ARPC5在肺鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑

人肺鱗癌細(xì)胞系SK-MES-1由本實(shí)驗(yàn)室保存。SK-MES-1為肺鱗癌患者轉(zhuǎn)移性胸腔積液分離出來的具有較強(qiáng)侵襲和轉(zhuǎn)移能力貼壁生長的細(xì)胞株。DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司。si-ARPC5購自美國Santa Cruz公司，LipofectamineTMRNAiMAX購自美國Invitrogen公司。TRIzol Reagent購自美國Invitrogen公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒One Step SYBR PrimeScript PLUS RT-PCR Kit購自大連Takara公司。兔抗人ARPC5單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。兔抗人GAPDH抗體購自上?？婆d公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自北京中杉金橋公司。DAB顯色劑購自武漢博士德公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)試劑盒購自上海博谷生物公司。Matrigel膠及Transwell小室購自美國BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SK-MES-1細(xì)胞系培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，pH值7.2～7.4，37℃，飽和濕度，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

APPC5特異性siRNA即si-ARPC5，購自Santa Cruz公司的成品(產(chǎn)品號(hào)：p16-ARC siRNA，sc-62733)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用陽離子脂質(zhì)體法，按Invitrogen公司LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將腫瘤細(xì)胞分為空白對照組即mock組(不含轉(zhuǎn)染試劑和si-ARPC5)、陰性對照組NC組(僅加轉(zhuǎn)染試劑)和實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染si-ARPC5)。用24孔板，轉(zhuǎn)染前1天細(xì)胞鋪板于500 μL含血清不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，達(dá)40%～50%時(shí)轉(zhuǎn)染。每孔細(xì)胞分別用50 μL DMEM無血清培養(yǎng)基稀釋6 pmol si-ARPC5及LipofectamineTMRNAiMAX試劑后混合。去掉培養(yǎng)板上的培養(yǎng)基，換為500 μL無血清培養(yǎng)基，混合物加入每孔，搖均。于37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的溫箱培養(yǎng)6 h后，換為含血清的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行各項(xiàng)檢測。

1.4 Real time qRT-PCR檢測SK-MES-1細(xì)胞ARPC5 mRNA的表達(dá)［15］

轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，采用TRIzol法提取細(xì)胞總蛋白，采用Takara一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒One Step SYBR PrimeScript PLUS RT-PCR Kit，并按說明書操作real-time qRT-PCR(美國ABI PRISM 7500 Real Time PCR System)。引物由Takara公司設(shè)計(jì)及合成。ARPC5基因的引物序列上游：5’-TGCCACTGGAGTAACACTGC-3’，下游：5’-CTCCCGTCAACACCAAGAAT-3’；看家基因GAPDH引物序列上游：5’-AAGGAGGCGGAGAAGAGGAC-3’，下游：5’-CGTCGTTACGAGTCACTTCAGG-3’。反應(yīng)完成后，確認(rèn)擴(kuò)增曲線和溶解曲線。擴(kuò)增參數(shù)：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)42℃ 5 min，95 ℃ 10 s (1個(gè)循環(huán))；PCR反應(yīng)95 ℃5 s，60 ℃ 34 s (40個(gè)循環(huán))；溶解曲線分析。每份樣本重復(fù)3次，取Ct值均值。ARPC5表達(dá)水平的數(shù)據(jù)結(jié)果以2-△△Ct的方法計(jì)算。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測SKMES-1細(xì)胞ARPC5蛋白的表達(dá)［15］

4 ℃收集轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞4×106個(gè)，裂解緩沖液處理，超聲粉碎細(xì)胞，于4 ℃、離心半徑6 cm、速率12 000 r/min條件下，離心5 min，提取上清液。取等量蛋白，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF 膜后，用考馬斯亮蘭染膜。兔抗人ARPC5單克隆抗體(1∶200)，兔抗人GAPDH抗體(1∶1 000)4 ℃溫育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶2 000)37 ℃溫育，DAB顯色。凝膠成像系統(tǒng)采集，灰度值測定，GAPDH為內(nèi)對照。

1.6 細(xì)胞增殖能力檢測(CCK-8實(shí)驗(yàn))［16］

對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)4×103個(gè)，分別于轉(zhuǎn)染后0、24、48和72 h每孔加入CCK-8 10 μL。繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h。酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度值(A)，細(xì)胞增殖率=A實(shí)驗(yàn)組/ A空白對照組。根據(jù)結(jié)果繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.7 細(xì)胞遷移能力檢測(劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn))［16］

將對數(shù)生長期細(xì)胞接種于24孔板，形成單層，細(xì)胞融合度達(dá)到60%以上時(shí)用移液器頭在培養(yǎng)板劃均勻“一”字線；PBS洗去漂浮細(xì)胞，更換培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，觀察拍照，測量細(xì)胞遷移距離。并計(jì)算各組細(xì)胞的劃痕修復(fù)率。劃痕修復(fù)率(%)=[0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/ 0 h劃痕寬度]×100%。

1.8 Transwell小室細(xì)胞侵襲能力檢測［16］

Transwell小室內(nèi)置8 μm孔徑聚碳酸酯微孔濾膜。在8孔中的上室內(nèi)加入稀釋的Matrigel膠100 μL，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%條件下培養(yǎng)3 h。加入無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，將轉(zhuǎn)染后48 h收集的細(xì)胞濃度調(diào)整至2×106個(gè)/mL，取100 μL細(xì)胞懸液滴入上室內(nèi)(2×105個(gè)細(xì)胞)。下室加入10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液，室溫溫育8 h，棄去上室液，擦掉Matrigel膠，甲醇固定，蘇木素染色，光鏡下計(jì)數(shù)隨機(jī)選取3個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)取其平均值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有計(jì)量資料以表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 si-ARPC5抑制肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1中ARPC5的表達(dá)

Real-time qRT-PCR法檢驗(yàn)各組細(xì)胞中ARPC5 mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，si-ARPC5轉(zhuǎn)染SK-MES-1細(xì)胞48 h后ARPC5 mRNA的表達(dá)明顯低于NC組和mock組，分別相差10.3和9.3倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.415，P=0.000；t=13.863，P=0.000)，而NC組和mock組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.331，P=0.254)，GAPDH為內(nèi)參(圖1 A)。Western blot法檢驗(yàn)各組細(xì)胞ARPC5蛋白水平的表達(dá)，顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-ARPC5 48 h后，ARPC5蛋白表達(dá)同樣較NC組和mock組顯著降低，分別相差3.2和3.4倍 (t=10.944，P=0.000；t=8.407，P=0.001)，NC組和mock組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.497，P=0.646)，GAPDH為內(nèi)參(圖1B、C)。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證si-ARPC5的轉(zhuǎn)染效率和其對ARPC5在mRNA和蛋白水平表達(dá)的抑制能力。

2.2 ARPC5基因表達(dá)下調(diào)對SK-MES-1細(xì)胞增殖能力的影響

應(yīng)用CCK-8法檢驗(yàn)各組細(xì)胞增殖能力。在si-ARPC5轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間，所測得的A值見表1。結(jié)果顯示，在0和24 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組和mock組及NC組細(xì)胞增殖水平差別不大，但在SKMES-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-ARPC5后72 h增殖表現(xiàn)較mock組和NC組有了明顯下降 (t=7.993，P=0.001；t=8.681，P=0.001)。表明ARPC5下調(diào)抑制了SK-MES-1細(xì)胞的增殖能力(圖2) 。

2.3 ARPC5基因表達(dá)下調(diào)對SK-MES-1細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測si-ARPC5對SK-MES-1細(xì)胞遷移能力的影響。在劃痕48 h后，觀察見si-ARPC5轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移不顯著，劃痕區(qū)僅略有縮窄，劃痕修復(fù)率為(43.32±0.23)%；而mock組和NC組中腫瘤細(xì)胞有明顯長入，劃痕區(qū)明顯縮窄，劃痕修復(fù)率為(73.11±0.43)%和(76.58±0.88)%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.348，P=0.002；t=10.614，P=0.000)。表明未轉(zhuǎn)染si-ARPC5的腫瘤細(xì)胞有更強(qiáng)的遷移能力，ARPC5基因表達(dá)下調(diào)抑制了SK-MES-1細(xì)胞的遷移能力(圖3)。

2.4 ARPC5基因表達(dá)下調(diào)對SK-MES-1細(xì)胞侵襲能力的影響

用Transwell小室法行細(xì)胞侵襲體外實(shí)驗(yàn)。對實(shí)驗(yàn)細(xì)胞8 h穿過Matrigel基膜的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-ARPC5的SK-MES-1細(xì)胞穿膜數(shù)為(27±6)個(gè)，mock組為(101±11)個(gè)，NC組為(92±9)個(gè)。實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于其他2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.229，P=0.001；t=8.391，P=0.001，圖4)。表明下調(diào)ARPC5基因表達(dá)能影響SK-MES-1細(xì)胞的侵襲能力。

3 討 論

ARPC5作為ARP2/3復(fù)合體的一份子參與肌動(dòng)蛋白的組裝和調(diào)節(jié)功能。但其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中作用的研究剛起步，現(xiàn)有的證據(jù)部分證明了其為癌基因的可能，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞游走等方面的作用正越來越得到重視。

本研究在Moriya等［15］的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)一步檢驗(yàn)ARPC5在肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移中的作用。我們選用肺鱗癌細(xì)胞系SK-MES-1進(jìn)行進(jìn)一步研究，以觀察ARPC5對癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響。我們使用ARPC5的siRNA抑制ARPC5在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)。并在mRNA和蛋白水平上都驗(yàn)證了ARPC5基因沉默的有效性。本研究應(yīng)用CCK-8法檢測SK-MES-1細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果表明在陰性對照組和空白對照組中SK-MES-1細(xì)胞的增殖能力遠(yuǎn)強(qiáng)于si-ARPC5組(P＜0.05)，證明ARPC5具有促進(jìn)SKMES-1細(xì)胞增殖的作用。我們應(yīng)用細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移修復(fù)能力遠(yuǎn)低于對照組(P＜0.05)，證明了ARPC5表達(dá)受抑制后SK-MES-1細(xì)胞的遷移能力也受到抑制。我們應(yīng)用Transwell小室實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ARPC5基因沉默后肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1侵襲能力均明顯受到了抑制，實(shí)驗(yàn)組的穿膜細(xì)胞明顯低于對照組(P＜0.05)，提示ARPC5應(yīng)該與肺侵襲能力有關(guān)。這些結(jié)果與Kinoshita等［16］在ARPC5對口腔鱗癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究結(jié)果一致。

肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重構(gòu)和再組裝進(jìn)而造成樹突狀偽足、板狀偽足和絲狀偽足的形成是多數(shù)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移行為的必要條件［6,8,11］。ARPC5參與并調(diào)節(jié)這一過程，促進(jìn)侵襲性偽足的產(chǎn)生，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的能力［13］。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ARPC5參與SK-MES-1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的過程。為進(jìn)一步研究ARPC5基因在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用，驗(yàn)證其為癌基因的可能性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Downregulation of actin related protein 2/3 complex subunit 5 inhibits proliferation, migration and invasion of lung squamous carcinoma cell line SK-MES-1

DU Jiang,ZHANG Lin (Department of

Thoracic Surgery, China Medical University Af fi liated No.1 Hospital, Shenyang Liaoning 110001, China)

ZHANG Lin E-mail: zhanglin_cmu@126.com

Background and purpose: Actin related protein 2/3 complex subunit 5 (ARPC5) is involved in the packaging of actin, and then affects the mobility of cells. It plays an important role in the formation of invadopodia of cancer cells. This study aimed to investigate the effect of ARPC5 gene-silence on cell proliferation, migration and invasion of lung squamous carcinoma cell line SK-MES-1. Methods: Under the induction of LipofectamineTMRNAiMAX, the recombinant of si-ARPC5 was transfected into SK-MES-1. The experiment set up 3 groups: blank (mock) group, negative control (NC) group and si-ARPC5 transfected group. Cell proliferation, migration and invasion assays were investigated by cell counting kit(CCK-8) method, scratch assay and Transwell Chambers respectively. Results: The result of qRT-PCR and Western blot displayed downregulation of ARPC5 in mRNA and protein level of SK-MES-1 cell. Proliferation rate of SK-MES-1 cells in 72 h after si-ARPC5 transfection was lower than those in mock and NC groups (t=7.993, t=8.681, P＜0.05). Compared to the mock and NC groups, the scratch repairing rate of the si-ARPC5 group was lower [(43.32±0.23)% vs (73.11±0.43)% and (76.58±0.88)%] (t=7.348, t=10.614, P＜0.05); And the number of penetrating the membrane was signi fi cantly reduced [(27±6) vs (101±11) and (92±9)] (t=10.229, t=8.391,P＜0.05). Conclusion: Downregulation of ARPC5 gene can inhibit the proliferation, migration, and invasion of SKMES-1 cell.

Lung squamous cell carcinoma; Actin related protein 2/3 complex subunit 5; Proliferation; Migration; Invasion

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.07.010

R734.2

A

1007-3639(2014)07-0529-06

2014-04-17

2014-05-29）

張林 E-mail:zhanglin_cmu@126.com