張勇法， 楊建英

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南洛陽 471023；2.河南科技大學醫(yī)學技術與工程學院，河南洛陽 471023）

免疫學檢測技術是利用抗原和抗體間的特異性反應，來識別和測定作為待測物的抗體/抗原，既能夠用于樣品的常規(guī)分析，也能夠用于樣品的定性篩選和定量測定。免疫學檢測技術具有靈敏度高、特異性強、方便、快速和經(jīng)濟性等優(yōu)點，在真菌毒素或獸藥殘留檢測中發(fā)揮著重要的作用。目前常用的免疫學檢測技術主要有放射免疫檢測技術、酶聯(lián)免疫檢測技術、化學發(fā)光免疫檢測技術、電化學免疫檢測技術、基于量子點的熒光免疫檢測技術及時間分辨熒光免疫檢測技術、抗體微陣列、免疫傳感器和膠體金免疫檢測技術等（Meng和Xi，2011）。本文對上述免疫檢測技術的優(yōu)缺點及其在真菌毒素或獸藥殘留檢測中的應用作一綜述。

1 放射免疫檢測技術

放射免疫檢測技術 （RIA）的優(yōu)點是靈敏度高、特異性強、精確性好、試劑價格低廉、樣品用量少。缺點是其放射性對人體及環(huán)境均有危害、對儀器設備要求高、半衰期較短、容易造成污染。周浩等（2012）用RIA法對蜂蜜中四環(huán)素類抗生素殘留量進行檢測，其結果與LC-MS法驗證的結果符合率達到100%，并與其他族抗生素無交叉反應。閆磊等（2010）采用RIA法對牛奶中的黃曲霉毒素含量進行大批量初步篩選，檢出限（LOD）達到0.25 μg/kg。Al-Mazeedi等（2010）采集市場上奶制品、雞蛋、動物組織等樣品，用RIA法檢測其四環(huán)素殘留量，并用LC/MS/MS法驗證，二者結果吻合度達80%～100%。

2 酶聯(lián)免疫檢測技術

酶聯(lián)免疫檢測技術（ELISA）的優(yōu)點是操作簡單、成本低、可批量檢測樣品、穩(wěn)定性好、有效期長。但其靈敏度不夠高，只能定性或半定量。Ji等（2011）采用ELISA法監(jiān)測小麥粉中嘔吐毒素（脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，DON）的含量，最低檢出限為0.02 μg/mL， 平均回收率達82% ～93%。Liu等（2010）采用間接競爭ELISA法檢測雞肉和肝臟組織中氯丙嗪的殘留量，實驗結果可靠。劉百紅等（2008）用建立的直接競爭ELISA法快速檢測豬肉等動物源性食品中磺胺嘧啶殘留，結果與同類英國RANDOX試劑盒符合率達到100%。

3 基于量子點的熒光免疫檢測技術

基于量子點的熒光免疫檢測技術（QIA法）具有靈敏度高、特異性好、操作簡單快捷，便于推廣等優(yōu)點，但其非特異性吸附問題很難解決。李園園等（2012）建立了間接競爭QIA法檢測花生中黃曲霉毒素B1，其靈敏度為0.023 ng/mL，檢出限為0.001 ng/mL，與傳統(tǒng)有機染料FITC二抗法相比，靈敏度可提高30倍。楊淑平等（2011）利用QIA法檢測小麥面粉中DON的含量，其檢出限為0.038 ng/mL，其靈敏度遠高于已報道的氣相色譜/電子捕獲檢測法 （GC/ECD）、高效液相色譜法（HPLC）和高效液相色譜-質譜聯(lián)用法（HPLC/MS）。Chen等（2009）建立了QIA法檢測雞肉中恩諾沙星的殘留量，檢出限為2.5 ng/mL，加標回收率為81%～94%，與ELISA法和HPLC法的檢測結果相關性很好。

4 時間分辨熒光免疫檢測技術

時間分辨熒光免疫檢測技術（TR-FIA）優(yōu)點是操作便捷、靈敏度高、特異性好、無污染、重復性好，易于自動化操作；然而對測試環(huán)境要求高、成本也高。但目前仍是最靈敏的微量分析技術，廣泛應用于生物學研究、臨床疾病診斷、食品安全及環(huán)境監(jiān)測等領域。Oku等（2011）為了監(jiān)測黑牛的發(fā)情周期，采用TR-FIA法檢測其牛奶和血漿中孕酮濃度，檢出限為1.53 ng/mL，加標回收率為86.5%～98.6%，批間與批內變異系數(shù)分別為7.51%、5.46%。楊潤琳等（2010）建立了T-2毒素間接競爭TR-FIA法，該方法靈敏度為0.2 pg/L，批間與批內變異系數(shù)分別為12.7%和7.5%，加標回收率為89.6%，與ELISA試劑盒檢測結果對比，相關系數(shù)達到92.6%。黃飚等（2008）建立了高靈敏度的赭曲霉毒素A的TR-FIA法，分別檢測了玉米和大麥等樣品中赭曲霉毒素A的含量，其靈敏度達到0.02 μg/L，平均回收率為95.8%，批間與批內變異系數(shù)分別為2.6%和5.2%。

5 化學發(fā)光免疫檢測技術

化學發(fā)光免疫檢測技術（CLIA）優(yōu)點是特異性好、靈敏度高、檢測范圍寬、無污染、有效期長、便于自動化操作。但對操作時間要求苛刻，否則工作曲線會發(fā)生漂移。主要用于臨床分析、環(huán)境監(jiān)測和藥物及食品檢測領域。Fang等（2011）建立了CLIA法，用來測定農(nóng)產(chǎn)品中殘留的黃曲霉毒素Bl，檢測靈敏度達到0.01 ng/g，加標回收率為79.8%～115.4%，批間和批內變異系數(shù)分別小于10.0%和12.2%，與商品化的ELISA試劑盒驗證結果相比，二者相關系數(shù)達0.9098。張慧麗等（2011）用CLIA法快速檢測牛奶中恩諾沙星的殘留量，其檢出限為239.9 pg/mL，加標回收率為99.0%～101.4%，批間和批內變異系數(shù)均小于15%。邱云青等（2010）建立的快速靈敏CLIA法檢測玉米粉中赭曲霉毒素的殘留量，檢出限為0.02 ng/mL，加標回收率為83.6%～105.8%。

6 電化學免疫檢測技術

電化學免疫檢測技術（ECLIA）優(yōu)點是靈敏度高、特異性強、操作便捷、安全可靠、適合大規(guī)模生產(chǎn)，尤其適用于微量樣品的檢測，但特異性較差。李利軍等（2009）建立了一種ECLIA法用于測定尿液中鹽酸氯丙嗪含量，其檢出限為6.0×10-7mol/L，加標回收率為97% ～107%。Liang等（2008）建立了一種ECLIA法用于檢測睪酮含量，檢出限為0.1 ng/mL。藍蘇梅等（2009）建立了一種ECLIA法測定膠囊中鹽酸克林霉素含量，檢出限為1.0×10-7mol/L，加標回收率為93%～102%。

7 抗體芯片檢測技術

抗體芯片也稱免疫芯片，其優(yōu)點操作簡單快捷、生產(chǎn)成本低、信息量大、用途廣泛、自動化程度高等，缺點是單克隆抗體不易獲得，被檢標本中的抗原或抗體含量較低難進行體外擴增或濃縮，芯片的封裝和儲存條件苛刻，對于分子量和濃度范圍極廣的待檢物難于定量分析等。Wang等（2012）將真菌毒素（如黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素M1、嘔吐毒素、赭曲霉毒素A、T-2毒素、玉米烯酮）與牛血清白蛋白偶聯(lián)，建立間接競爭抗體芯片檢測技術，加標回收率為80%～120%，其最低檢測濃度分別是 0.01、0.24、15.45、15.39、0.05、0.01 ng/mL。Zhong等（2010）通過抗體芯片檢測技術檢測雞肉組織中克倫特羅的殘留量，與間接ELISA方法相比加標回收率升高了14%，達到90%。

8 免疫傳感器

免疫傳感器優(yōu)點是靈敏度較高、樣品需要量少、樣品無需處理、實時連續(xù)監(jiān)測、操作簡單快捷、應用范圍廣。缺點是成本高、非特異性強、對溫度、樣品組成等敏感，影響實驗結果。在食品安全、臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、真菌毒素或獸藥殘留檢測等領域應用廣泛。Li等（2012）報道利用表面等離子體共振傳感器法 （SPR）檢測真菌毒素，其中DON的檢出限達0.5 ng/g，HT-2毒素在早餐谷類、小麥和嬰兒食品中的檢出限分別達到 25、26、25 μg/kg。Dumont等（2006）用SPR檢測了蝦肉組織中4種抗生素：甲砜霉素（硫霉素）、氟苯尼考（氟洛芬，氟甲砜霉素）、氟苯尼考胺和氯霉素的殘留，最低檢測濃 度 分 別 是 0.1、0.2、250、0.5 ppb。 Haughey 等（2001）報道了利用免疫傳感器法檢測牛尿中克倫特羅的殘留量，操作時間僅7 min，檢出限為0.27 ng/mL，回收率在95%左右，批間和批內變異系數(shù)分別為9.2%～12.7%和4.7%～7.6%。

9 膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析法（GICA）具有操作簡單快速、設備簡單、無污染、肉眼直接觀察結果、便于攜帶等優(yōu)點，不過只能用于定性（僅限陰性和陽性之分）及半定量分析（僅能把待測物含量確定于某一范圍）。Xu等（2010）通過膠體金免疫試紙條法快速檢測小麥和玉米中DON的殘留量，檢出限為50 ng/mL，并用氣相色譜/質譜（GC/MS）法驗證，二者具有很好的相關性。Zhu等（2008）利用膠體金免疫試紙條法10 min內檢測了12種氟喹諾酮類藥物，其中2種藥物的檢出限為25 ng/mL，其余10種為50 ng/mL。陳義強等（2009）通過膠體金免疫層析法對樣品進行現(xiàn)場快速篩選，僅10 min可完成操作，并與傳統(tǒng)的ELISA法和HPLC法結果對比，三者的測定結果完全相符。

10 小結

真菌毒素和獸藥殘留與食品安全息息相關，研究其相應的檢測技術顯得尤為重要。免疫檢測技術的研究是當前檢測與診斷科學技術領域里最為活躍的分支，因此，本文分別分析了多種免疫學檢測技術的優(yōu)缺點及使用情況，為尋找準確、靈敏、經(jīng)濟、高效的檢測方法，保證食品安全，確保人民健康奠定了堅實的理論基礎。

[1]陳義強，肖希龍，李德發(fā).豬組織中卡那霉素殘留膠體金免疫層析、ELISA及HPLC檢測方法研究[A].中國畜牧獸醫(yī)學會，中國畜牧獸醫(yī)學會2009學術年會論文集（上冊）[C].北京：中國畜牧獸醫(yī)學會，2009.284～288.

[2]黃飚，時瑾，朱嵐，等.赭曲霉毒素A時間分辨熒光免疫分析法的建立及其考核[J].標記免疫分析與臨床，2008，15（3）：174 ～ 177.

[3]藍蘇梅，李利軍，蔡卓，等.聯(lián)吡啶釕體系電化學發(fā)光法測定克林霉素的研究[J].分析測試學報，2009，28（4）：466 ～ 469.

[4]李利軍，陳昌東，程吳，等.鹽酸氯丙嗪.聯(lián)吡啶釕體系在多壁碳納米管修飾電極上的電化學發(fā)光行為研究及鹽酸氯丙嗪的測定[J].分析測試學報，2009，28（1）：37 ～ 43.

[5]李園園，李培武，張奇，等.量子點標記熒光免疫法檢測花生中黃曲霉毒素 B1[J].中國油料作物學報，2012，34（4）：438 ～ 442.

[6]劉百紅，熊寧，王喜亮，等.直接競爭ELISA法快速檢測動物源性食品中磺胺嘧啶殘留[J].中國獸藥雜志，2008，42（2）：16 ～ 19.

[7]邱云青，王偉，李鳳琴.化學發(fā)光酶免疫分析法檢測食品中赭曲霉毒素[J].食品科學，2010，31（24）：432 ～ 435.

[8]閆磊，李卓，張燕.牛奶中黃曲霉毒素的放射免疫法檢測[J].食品研究與開發(fā)，2010，31（1）：135 ～ 137.

[9]楊潤琳，計融，江濤，等.T-2毒素的高靈敏時間分辨熒光免疫分析[J].食品與機械，2010，26（1）：74 ～ 76.

[10]楊淑平，金鑫，鄭佳，等.高性能CdTe/CdS核殼型量子點的制備及應用于小麥面粉中嘔吐毒素的熒光免疫檢測研究[J].化學學報，2011，69（6）：687～692.

[11]張慧麗，于斐，吳擁軍，等.化學發(fā)光酶免疫分析法快速測定牛奶中恩諾沙星的含量[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2011，23（5）：398 ～ 401.

[12]周浩，李俊霞，楊紅，等.蜂蜜中四環(huán)素類抗生素的放射免疫法檢測[J].食品研究與開發(fā)，2012，33（11）：160 ～ 162.

[13]Al-Mazeedi H M，Abbas A B，Alomirah H F，et al.Screening for tetracycline residues in food products of animal origin in the State of Kuwait using Charm II radio-immunoassay and LC/MS/MS methods[J].Food Addit Contam A，2010，27（3）：291 ～ 301.

[14]Chen J X，Xu F，Jiang H Y，et al.A novel quantum dot-based fluoroimmunoassay method for detection of Enrofloxacin residue in chicken muscle tissue[J].Food Chem，2009，113（4）：1197 ～ 1201.

[15]Dumont V，Huet A C，Traynor I，et al.A surface plasmon resonance biosensor assay for the simultaneous determination of thiamphenicol，florefenicol，florefenicol amine and chloramphenicol residues in shrimps[J].Anal Chim Acta，2006，567（2）：179 ～ 183.

[16]Fang L，Chen H，Ying X，et al.Micro-plate chemiluminescence enzyme immuneoassay for aflatoxin B1in agricultural products[J].Talanta，2011，84（1）：216～222.

[17]Haughey S A，Baxter G A，Elliott C T，et al.Determination of Clenbuterol Residues in Bovine Urine by Optical Immunobiosensor Assay[J].J AOAC Int，2001，84（4）：1025 ～ 1030.

[18]Ji F，Li H，Xu J，et al.Enzyme-Linked Immunosorbent-Assay for Deoxynivalenol（DON）[J].Toxins，2011，3（8）：968 ～ 978.

[19]Li Y，Liu X，Lin Z.Recent developments and applications of surface plasmon resonance biosensors for the detection of mycotoxins in foodstuffs[J].Food Chem，2012，132（3）：1549 ～ 1554.

[20]Liang K Z，Qi J S，Mu W J，et al.Biomolecules/gold nanowires-doped sol-gel film for label-free electrochemical immunoassay of testosterone[J].J Biochem Bioph Meth，2008，70（6）：1156 ～ 1162.

[21]Liu W，Li W，Yin W，et al.Preparation of a monoclonal antibody and development of an indirect competitive ELISA for the detection of chlorpromazine residue in chicken and swine liver[J].J Sci Food Agr，2010，90（11）：1789～1795.

[22]Meng M，Xi R.Review：Current Development of Immunoassay for Analyzing Veterinary Drug Residue in Foods and Food Products[J].Anal Lett，2011，44（15）：2543 ～ 2558.

[23]Oku Y，Osawa T，Hirata T，et al.Validation of a direct time-resolved fluoroimmunoassay for progesterone in milk from dairy and beef COWS[J].Vet J，2011，190（2）：244 ～ 248.

[24]Wang Y，Liu N，Ning B，et al.Simultaneous and rapid detection of six different mycotoxins using an immunochip[J].Biosens Bioelectron，2012，34（1）：44 ～ 50.

[25]Xu Y，Huang Z B，He Q H，et al.Development of an immunochromatographic strip test for the rapid detection of deoxynivalenol in wheat and maize[J].Food Chem，2010，119（2）： 834 ～ 839.

[26]Zhong L，Zhang W，Zer C，et al.Protein microarray：sensitive and effective immuno detection for drug residues[J].BMC Biotechnol，2010，10：12.

[27]Zhu Y，Li L，Wang Z，et al.Development of an immunochromatography strip for the rapid detection of 12 fluoroquinolones in chicken muscle and liver[J].J Agric Food Chem，2008，56（14）：5469 ～ 5474.■