張今堯，葉 平，王 浩，韓 磊解放軍總醫(yī)院 南樓心血管二科，北京 00853；海軍總醫(yī)院 航空潛水醫(yī)學(xué)中心，北京 00037

人體衰老是一系列復(fù)雜的特定變化過程，主要表現(xiàn)為多器官功能減退，修復(fù)能力下降，易于向病態(tài)轉(zhuǎn)化等[1]。研究證實(shí)，衰老增加機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生多種炎癥因子，增加細(xì)胞凋亡[2-4]。而他汀類藥物對(duì)心血管保護(hù)具有多效性，包括改善血管內(nèi)皮功能、降低血管炎癥反應(yīng)、抑制平滑肌增殖和免疫調(diào)節(jié)等。文獻(xiàn)報(bào)道他汀類藥物對(duì)除心臟外的肝、腎組織亦存在相似作用[5-6]。但上述作用對(duì)衰老個(gè)體是否仍有作用未見報(bào)道，他汀類藥物對(duì)個(gè)體多器官氧化應(yīng)激指標(biāo)的觀察亦未見報(bào)道。本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討衰老時(shí)機(jī)體內(nèi)多器官氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化，以及阿托伐他汀干預(yù)后的變化，揭示他汀類藥物對(duì)機(jī)體多器官的作用機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠，自北京維通利華公司購(gòu)入10月齡Wistar大鼠90只，飼養(yǎng)至20月齡，進(jìn)行編號(hào)及稱重。待上述大鼠飼養(yǎng)至24月齡時(shí)，購(gòu)入3月齡大鼠30只，雌雄各半。

2 藥品及試劑 阿托伐他汀大連輝瑞制藥有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)、脂褐素(lipofuscin，LPF)檢測(cè)試劑盒南京建成生物工程研究所。

3 實(shí)驗(yàn)儀器 臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)自Sigma公司；高速冷凍離心機(jī)Heraeus Labofuge 400；微量移液器Gilson公司；顯微鏡Olympus BX40；熒光分光光度計(jì)RF-5301PC購(gòu)自日本島津公司。

4 分組及給藥方案 將20月齡Wistar大鼠隨機(jī)分為老年對(duì)照組、大劑量阿托伐他汀組和小劑量阿托伐他汀組，每組30只。將阿托伐他汀制成粉末后，加入0.9%氯化鈉注射液，分別制成0.1 mg/ml及1 mg/ml混懸液。其中大劑量他汀組大鼠按照10 mg/(kg·d)給予1 mg/m l混懸液灌胃處理，小劑量他汀組大鼠按照1 mg/(kg·d)給予0.1 mg/m l混懸液灌胃處理。老年對(duì)照組大鼠根據(jù)體質(zhì)量給予相應(yīng)體積的0.9%氯化鈉注射液灌胃。各組大鼠每周稱1次體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量水平的變化調(diào)整給藥劑量，各組大鼠灌胃4個(gè)月至24月齡。灌胃至24月齡時(shí)，老年對(duì)照組存活大鼠27只，小劑量阿托伐他汀組存活大鼠24只，大劑量阿托伐他汀組存活大鼠26只。另購(gòu)入30只3月齡Wistar大鼠作為青年對(duì)照組，稱重和編號(hào)后按上述標(biāo)準(zhǔn)予0.9%氯化鈉注射液灌胃。

5 血液及組織標(biāo)本留存 實(shí)驗(yàn)采用喂養(yǎng)至24月齡的老年對(duì)照組、大劑量他汀組、小劑量他汀組大鼠及新購(gòu)入3月齡青年組大鼠。將大鼠固定于小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)臺(tái)，采用10%烏拉坦腹腔注射麻醉(0.1 ml/kg)。依次分離大鼠頸部皮膚及皮下組織，以5 m l注射器自頸動(dòng)脈抽取血液標(biāo)本，于離心機(jī)中1 000 r/min離心15 min，取血清樣本于-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩＜糸_大鼠胸部皮膚及胸、腹腔，迅速取出心臟、肝、腎，以預(yù)冷的0.9%氯化鈉注射液沖洗血液后，以干凈濾紙吸去殘留的水分，放于標(biāo)本盒中，迅速放入液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

6 檢測(cè)指標(biāo) 1)血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè)：取大鼠血清樣本，按照試劑盒說明書操作。測(cè)定CAT、SOD、NOS、MDA含量。2)各組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè)：取大鼠各組織，以0.9%氯化鈉注射液沖凈血液后，用濾紙吸去多余水分，稱重后放入勻漿器內(nèi)，加入9倍于組織重量的預(yù)冷0.9%氯化鈉注射液，在冰浴條件下勻漿，制成10%的組織勻漿液，于4℃條件下3 000 r/min離心15 min，取上清液。按照相應(yīng)試劑盒說明書操作，測(cè)定相應(yīng)組織SOD、MDA、CAT、NOS、LPF含量。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以-x±s表示，各組數(shù)據(jù)方差齊性，呈正態(tài)分布。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)變化 與老年對(duì)照組相比，青年對(duì)照組及大劑量他汀組血清中CAT、SOD、NOS均顯著升高(P＜0.01)，MDA顯著降低(P＜0.01)。與老年對(duì)照組相比，小劑量他汀組血清中CAT顯著升高(P＜0.01)，MDA顯著降低(P＜0.01)；NOS升高(P＜0.05)，SOD差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2 各組大鼠組織中CAT變化 與老年對(duì)照組相比，青年對(duì)照組、大劑量他汀組中心臟、肝、腎中CAT均顯著升高(P＜0.01)；小劑量他汀組中心臟及腎CAT顯著升高(P＜0.01)，肝中CAT升高(P＜0.05)。見圖1。

圖 1 各組大鼠多器官CAT變化與老年對(duì)照組比較，a P＜0.01，b P＜0.05Fig. 1 Serum CAT levels in different groups a P＜0.01，b P＜0.05, vs elderly control group

3 各組大鼠組織中SOD變化 與老年對(duì)照組相比，青年對(duì)照組、大劑量他汀組中心臟、肝、腎中SOD均顯著升高(P＜0.01)；小劑量他汀組中肝及腎SOD顯著升高(P＜0.01)，心臟中差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

表1 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)變化Tab. 1 Serum indications for oxidative stress in different groups(-x±s)

4 各組大鼠組織中NOS變化 與老年對(duì)照組相比，青年對(duì)照組、小劑量他汀組、大劑量他汀組中心臟、肝、腎中NOS均顯著升高(P＜0.01)。見圖3。

5 各組大鼠組織中LPF變化 與老年對(duì)照組相比，青年對(duì)照組、小劑量他汀組、大劑量他汀組肝、腎中LPF均顯著降低(P＜0.01)。見圖4。

圖 2 各組大鼠多器官SOD變化與老年對(duì)照組比較， a P＜0.01Fig. 2 Serum SOD levels in different groups a P＜0.01, vs elderly control group

圖 3 各組大鼠多器官NOS變化與老年對(duì)照組比較， a P＜0.01Fig. 3 Serum NOS levels in different groups a P＜0.01, vs elderly control group

圖 4 各組大鼠多器官LPF變化與老年對(duì)照組比較， a P＜0.01Fig. 4 Serum LPF levels in different groups a P＜0.01, vs elderly control group

圖 5 各組大鼠多器官M(fèi)DA變化與老年對(duì)照組比較， a P＜0.01Fig. 5 Serum MDA levels in different groups a P＜0.01, vs elderly control group

6 各組大鼠組織中MDA變化 與老年對(duì)照組相比，青年對(duì)照組、大劑量他汀組肝、腎中MDA均顯著降低(P＜0.01)；小劑量他汀組肝MDA顯著降低(P＜0.01)，腎中差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖5。

討 論

目前，關(guān)于衰老的發(fā)生機(jī)制方面的學(xué)說之一為自由基學(xué)說。衰老的自由基學(xué)說最早由英國(guó)學(xué)者Harman[7]于1956年提出，其主要觀點(diǎn)是機(jī)體在代謝過程中大量的內(nèi)生自由基損害細(xì)胞是機(jī)體衰老的重要原因。由于許多體內(nèi)的非自由基，如乙醛等也可導(dǎo)致細(xì)胞的氧化損害，故目前的衰老機(jī)制被認(rèn)為是體內(nèi)氧化物與抗氧化物間的失衡，即衰老的氧化應(yīng)激學(xué)說[8]。當(dāng)體內(nèi)氧化物積聚過多時(shí)，DNA、線粒體等重要細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到損害，導(dǎo)致衰老發(fā)生[9-10]。而SOD、NOS等則可保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損害[11-12]。MDA、LPF作為反應(yīng)機(jī)體氧化應(yīng)激、衰老狀態(tài)以及抗衰老干預(yù)措施效果的指標(biāo)，已為廣大學(xué)者所公認(rèn)。既往的研究已證實(shí)，上述指標(biāo)在生物體內(nèi)的含量隨年齡增加而逐漸增加[13]。此前韓磊等[14]采用與本實(shí)驗(yàn)相同方法，已明確與老年對(duì)照組相比，青年對(duì)照組及兩種劑量阿托伐他汀組大鼠的心肌MDA、LPF含量顯著降低。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，隨機(jī)體的衰老，MDA含量增加，且此現(xiàn)象不僅存在于血清中，亦存在于心臟、肝、腎多器官內(nèi)。隨機(jī)體的衰老，LPF在多器官內(nèi)的含量亦增加。而CAT、NOS、SOD等作為體內(nèi)抗氧化物、改善氧化應(yīng)激狀態(tài)的主要因子，在實(shí)驗(yàn)研究中常被用來作為反映機(jī)體氧化應(yīng)激水平、衰老情況的參照指標(biāo)和評(píng)價(jià)抗衰老干預(yù)措施效果的指標(biāo)。因此在本研究中，我們亦選擇CAT、NOS、SOD作為反映老年大鼠多器官衰老狀態(tài)的指標(biāo)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，同青年大鼠相比，老年大鼠血清及各組織內(nèi)CAT、NOS、SOD的含量顯著降低，這一結(jié)果表明24月齡的Wistar鼠多器官表現(xiàn)出了顯著衰老的特點(diǎn)，并進(jìn)一步說明衰老大鼠模型是成功的。

有研究報(bào)道，氟伐他汀對(duì)2型糖尿病合并高膽固醇血癥患者具有抗氧化作用[15]。阿托伐他汀可以減輕血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)[5]。辛伐他汀在肝缺血再灌注過程中使過氧化氫酶含量升高[16]。阿托伐他汀可減少高膽固醇血癥兔脂類過氧化物的水平[17]。在本研究中，給予阿托伐他汀干預(yù)后，大鼠多器官內(nèi)的MDA、脂褐素水平均顯著降低，而CAT、NOS、SOD活性顯著增高。小劑量他汀組血清內(nèi)SOD、心臟內(nèi)SOD、腎內(nèi)MDA較老年組無顯著變化，但大劑量他汀組上述指標(biāo)則出現(xiàn)顯著變化，說明此效應(yīng)可能與阿托伐他汀的劑量相關(guān)。此前Rinaldi等[18]發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可劑量依賴性地增強(qiáng)小鼠肺、肝、腎多器官PPARα的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)多種炎性因子，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合。本實(shí)驗(yàn)提示，阿托伐他汀可以明顯抑制老年大鼠多器官的氧化應(yīng)激水平。同時(shí)也進(jìn)一步提示，阿托伐他汀通過調(diào)節(jié)解體衰老過程中的氧化應(yīng)激水平達(dá)到抑制衰老的作用。

最新的研究提示對(duì)于老年無心血管疾病患者，他汀類藥物仍可減少心肌梗死及卒中的發(fā)生[19]。此研究一方面肯定了他汀對(duì)于老年患者的安全性，更重要的是提示絕大部分老年患者均可從他汀類藥物中獲益。本實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)對(duì)于正常衰老研究對(duì)象，他汀類藥物可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生有利影響。但就本實(shí)驗(yàn)而言，部分小劑量他汀組指標(biāo)與老年對(duì)照組相比差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本量相對(duì)較少有關(guān)，而大劑量他汀組較老年對(duì)照組各指標(biāo)均有顯著變化。綜上所述，阿托伐他汀的長(zhǎng)期干預(yù)可減輕氧化應(yīng)激水平，起到抵抗多器官衰老的作用。

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