（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

煙草重要基因篇：5. 煙草香氣物質(zhì)合成代謝相關(guān)基因

呂 婧

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

煙草中的香氣物質(zhì)是煙草植株體內(nèi)形成的一類次生代謝產(chǎn)物，目前按照致香功能團(tuán)可分為酸類、醇類、酮類、醛類、酯類、酚類等[1]，其中對煙草香氣貢獻(xiàn)最大的 3 類物質(zhì)分別為多酚類化合物、萜類化合物以及生物堿。近年來，隨著分子生物學(xué)、生物化學(xué)、生物信息學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，有關(guān)這3類物質(zhì)合成途徑中的關(guān)鍵酶基因研究也漸漸深入。

1 多酚類化合物相關(guān)合成基因

目前在煙草中已發(fā)現(xiàn)的酚類包括單寧類、香豆素類、黃酮類、花色素類、簡單酚衍生物等，這些酚類物質(zhì)通過苯丙烷類代謝途徑生成，廣泛地參與調(diào)節(jié)生長發(fā)育、授粉識別和生物防御等各種生理活動[2]。其代謝途徑關(guān)鍵酶主要有苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)、4-香豆酸輔酶 A 連接酶(4CL)、查爾酮異構(gòu)酶(CHI)、香豆酸-3-羥化酶(C3H)、咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)、咖啡酰輔酶 A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(CCoAOMT)、阿魏酸-5-羥化酶(F5H)和肉桂酰輔酶 A 還原酶(CCR)等[3]。PAL 是苯丙烷類代謝途徑中的限速酶和關(guān)鍵酶，目前已從普通煙草(Nicotiana tabacum L.)中得到 6 條基因序列，平均長度為 3747 bp[4]；Nagai等發(fā)現(xiàn)，在普通煙草(Bright Yellow T-13)細(xì)胞培養(yǎng)物中加入激動素可以增強(qiáng) PAL 的活性，該試驗(yàn)之前在菜豆中已得到證實(shí)[5]，Nagai等[6]因此從普通煙草中克隆出 PAL 全長 cDNA；Reichert等[7]從普通煙草中克隆到的 4 個 PAL 基因可以在多個器官中共表達(dá)，并且可同時被酵母誘導(dǎo)子和茉莉酮酸甲酯所誘導(dǎo)。C4H 是苯丙烷途徑的第 2 個關(guān)鍵酶，屬于細(xì)胞色素單加氧酶 P450 超家族成員，其表達(dá)活性受不同因素（光照、病害、機(jī)械損傷等）影響，并與木質(zhì)素合成密切相關(guān)[8]，Szatmari等[9]對普通煙草做逆境處理，挑選文庫做隨機(jī)測序，得到 C4H 基因相關(guān)的 EST 序列，其功能有待進(jìn)一步深入研究。4CL 屬于木質(zhì)素生物合成關(guān)鍵酶之一，它作用于苯丙酸途徑中最后一步反應(yīng)，是苯丙酸途徑與木質(zhì)素特異合成途徑的轉(zhuǎn)折點(diǎn)[10]；Lee等[11]從普通煙草 cDNA 文庫中得到編碼 4CL 的 cDNA 克隆，通過 Northern 雜交顯示其 mRNA 在莖中表達(dá)量最大。Nishihara 等[12]在普通煙草花瓣中克隆得到 CHI 基因，通過 RNA 干擾發(fā)現(xiàn)植株花色素減少、花瓣中黃酮類物質(zhì)含量發(fā)生改變并且花粉中查爾酮大量累積，該結(jié)果首次證明高等植物中采用轉(zhuǎn)基因手段抑制CHI表達(dá)的可行性，證實(shí) CHI基因在查爾酮環(huán)化生成黃烷酮的合成代謝途徑中起著重要作用。

參與苯丙烷代謝途徑的酶多種多樣，這些酶系活性的變化、中間產(chǎn)物及其進(jìn)一步轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物同植物發(fā)育、對病原菌侵染的抗性以及色素的形成等生理活動有著密切的關(guān)系[13]，陳愛國等[14]發(fā)現(xiàn) PAL、C4H、4CL活性和多酚總量在普通煙草適熟采收時最高，多酚生物合成積累的主要影響酶是C4H。目前在煙草中許多參與苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵酶基因還未得到，已克隆基因所在代謝網(wǎng)絡(luò)的上下游調(diào)控機(jī)制還需更深入的探討。

2 萜類化合物合成相關(guān)基因

煙草中的萜類化合物主要包括單萜、二萜和四萜，單萜化合物有檸檬醛、薄荷醇、香葉醇等，是煙草葉面揮發(fā)物的主要組成成分[10]；二萜化合物包括新植二烯、類西柏烷類和賴百當(dāng)類；四萜化合物中類胡蘿卜素不僅決定調(diào)制后煙葉的顏色，其降解產(chǎn)物中的許多物質(zhì)(大馬酮、紫羅蘭酮、巨豆三烯酮、二烯獼猴桃內(nèi)酯等) 是煙葉中重要的致香物質(zhì)[15]。這些萜類物質(zhì)可分別由甲基赤蘚醇 4-磷酸途徑(MEP)和甲羥戊酸途徑(MVA)途徑 2 條獨(dú)立途徑生成[16]。現(xiàn)已確定，MEP 途徑的酶由核基因組編碼并進(jìn)入質(zhì)體，而 MVA 途徑的酶分布于不同的亞細(xì)胞間隔中。當(dāng)野生型植株的MVA途徑或者M(jìn)EP 途徑上某種代謝酶的表達(dá)受到特異性抑制劑處理而產(chǎn)生無效突變體時，都會導(dǎo)致植株發(fā)育阻礙和苗期致死，說明單獨(dú)一條代謝途徑的失效無法被其余途徑所彌補(bǔ)[17]。MEP 和 MVA 代謝途徑關(guān)鍵酶主要有羥甲基戊二酰 CoA 還原酶(HMGR)、甲羥戊酸激酶(MK)、5-磷酸脫氧木酮糖合成酶(DXS)、5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶(DXR)、4-磷酸-2C-甲基赤蘚糖醇-4-胞苷焦磷酸合成酶(CMS)等。HMGR 催化羥甲基戊二酰 CoA 生成甲羥戊酸，屬于 MVA 代謝途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)步驟，是萜類合成途徑中第 1 個限速酶[18]，Crevenat等從普通煙草愈傷組織中克隆了 3 條 HMGR的 cDNA 序列(GenBank 登錄號 AF004232.1、AF004233.1 和 U60452.1)，平均長度為 2419 bp。MK 是控制整個甲羥戊酸途徑的限速酶之一，目前中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所已經(jīng)從林煙草(Nicotiana sylvestris)中克隆了一條 MK cDNA 全長序列(GenBank 登錄號 KC871597)。在普通煙草中已發(fā)現(xiàn) 3 條 DXS 相關(guān)序列(GenBank 登錄號 AJ291721.1、FN429979.1 和 EU650419.1)，全長 2386 bp。在普通煙草中已克隆一條全長1804 bp 的 DXR 序列(GenBank 登錄號 DQ839130.1)。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所已經(jīng)從林煙草中克隆了一條 CMS 的 cDNA 全長序列(GenBank 登錄號 KC961733.1 )，表達(dá)分析證實(shí)，該基因在葉片中表達(dá)量最大。類異戊二烯是自然界廣泛存在、具有重要經(jīng)濟(jì)價值的一類天然化合物。相關(guān)過表達(dá)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MEP途徑由數(shù)個酶共同控制著代謝流，而 MVA 途徑則有著單一的調(diào)控步驟。目前通過分子生物學(xué)、生物信息學(xué)等手段研究有關(guān)類異戊二烯合成途徑已經(jīng)取得了較大進(jìn)展，針對植物細(xì)胞進(jìn)行改良的代謝工程在增加萜類產(chǎn)量與改變萜類分布方面影響顯著，可有效地提升植物風(fēng)味、改變顏色[19]。

3 生物堿合成相關(guān)基因

普通煙草栽培品種中主要有煙堿、降煙堿、新煙草堿和假木賊堿4種生物堿，其中煙堿的含量最高，這些生物堿分別由不同代謝途徑生成。目前有關(guān)莨菪堿、煙堿和黃連素生物合成途徑的相關(guān)基因已有克隆，同時兩條分支代謝途徑的關(guān)鍵酶已用于代謝工程，它們分別為：顛茄與林煙草轉(zhuǎn)基因植株中的腐胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)、黃連與加州罌粟花懸浮細(xì)胞中的(S)-斯氏紫堇堿-9-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(SMT)的表達(dá)已用于代謝工程[20]。PMT 被認(rèn)為是煙堿合成的限速酶，催化二胺腐胺甲基化生成 N-甲基腐胺。Winz 和 Baldwin[21]對漸窄葉煙草(Nicotiana attenuata)莖和根做甲基茉莉酮酸酯處理 10 h 后，根部 PMT 的轉(zhuǎn)錄本與煙堿含量急劇增加，同時根部施用乙烯利會抑制該反應(yīng)，從而推斷耐煙堿的昆蟲攻擊會引起漸窄葉煙草產(chǎn)生乙烯，直接抑制煙堿的氮合成。SMT 屬于腺苷蛋氨酸(SAM)依賴的 O-甲基轉(zhuǎn)移酶家族，煙堿含量的高低對煙草產(chǎn)品的質(zhì)量起著重要的作用，有關(guān)代謝途徑中限速關(guān)鍵酶仍是未知，目前已有調(diào)控?zé)焿A以及亞硝胺表達(dá)水平的相關(guān)專利[22]。

4 問題與展望

目前利用基因工程手段對香氣代謝途徑的調(diào)控還存在著以下問題：研究涉及的非模式植物已分離基因數(shù)目較少、一些關(guān)鍵酶的作用機(jī)制仍存在爭議、三種生物合成途徑中的相關(guān)酶含量少難以檢測等。在已經(jīng)克隆得到的關(guān)鍵酶基因序列中，利用轉(zhuǎn)基因手段分析香氣物質(zhì)變化的研究少見報(bào)道。任民[23]利用 SSR 和TRAP 標(biāo)記對高香氣普通煙草進(jìn)行了遺傳定位研究，發(fā)現(xiàn)煙草高香氣特征性狀屬于孟德爾顯性質(zhì)量遺傳，篩選到一個距離高香氣性狀 8.37cM 的 SSR 標(biāo)記。由于酶和底物具有多樣性，煙草香氣品質(zhì)的改良未來可以通過同時轉(zhuǎn)入多條關(guān)鍵酶基因，以期獲得高香氣表達(dá)的煙草品種。未來的研究重點(diǎn)可以從進(jìn)一步補(bǔ)充、完善香氣物質(zhì)代謝合成途徑及其網(wǎng)絡(luò)，明確各網(wǎng)絡(luò)之間的聯(lián)系和媒介，開展關(guān)鍵酶基因的克隆、表達(dá)分析和調(diào)控機(jī)制以及在不同時空表達(dá)的調(diào)控因子等方面開展。同時分離相關(guān)啟動子，實(shí)現(xiàn)各種香氣成分在特定時間和部位中的高效表達(dá)，為改良煙草香氣品質(zhì)、開發(fā)和利用香氣化合物提供誘人的前景。

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