趙 玉 歐陽斌 耿 強(qiáng)，＊

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院（300193）；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院男科

男性不育癥是影響家庭和睦以及社會穩(wěn)定的全球性問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查，有將近15%的育齡夫婦存在不孕不育問題，男女雙方原因各占50%［1］，而引起男性不育癥的主要原因包括物理因素、化學(xué)因素、內(nèi)分泌因素、環(huán)境因素、遺傳因素等，但是相當(dāng)一部分患者原因不明，國內(nèi)外近年來關(guān)于男性不育癥的基礎(chǔ)研究越來越多，相關(guān)的動物模型建立發(fā)展迅速。本文將近年來有關(guān)男性不育癥動物模型的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為有關(guān)男性不育方面的基礎(chǔ)及臨床研究提供參考。

1 物理因素

1.1 熱效應(yīng)

哺乳動物睪丸的熱敏性決定了其需要在適宜的溫度下才能發(fā)揮正常的生精功能，故大多數(shù)雄性動物睪丸的生長位置在腹部及腹部外周。睪丸組織溫度低于體溫，是精子生成的基本保證。睪丸溫度超過所需適宜溫度，生精功能將發(fā)生改變［2］，故可通過給予睪丸熱應(yīng)激建立生精功能異常的動物模型。

一般能夠建立熱效應(yīng)的手段包括水浴加熱、激光、紅外線等，但是實(shí)驗(yàn)中主要采用水浴方法，因?yàn)槠洳僮骱唵巍⒖煽匦詮?qiáng)，不易造成動物其他臟器的損害。Kanter等［3］通過水浴加熱兔睪丸建立不育癥動物模型，睪丸處在43℃的恒溫水浴中30 min后，兔睪丸生精功能異常。通過觀察發(fā)現(xiàn)高溫能夠顯著降低兔睪丸內(nèi)谷胱甘肽的含量以及超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性。此外，接觸高熱能夠?qū)е虏G丸內(nèi)脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)，繼而影響正常精子的生成。Pérez-Crespo等［4］運(yùn)用同樣的方法，將小鼠置于43℃水浴30 min，隨后將小鼠附睪內(nèi)的成熟精子進(jìn)行回收并觀察熱暴露后的精子數(shù)量、精子活率、運(yùn)動軌跡、前向運(yùn)動精子和精子DNA完整性的變化，發(fā)現(xiàn)瞬間適度高溫能夠?qū)е律臣?xì)胞死亡，精子數(shù)量及活力降低，且精母細(xì)胞對于熱暴露有更高的敏感性。

1.2 輻射效應(yīng)

通過對實(shí)驗(yàn)動物生殖器官進(jìn)行輻射處理，可以得到相應(yīng)的不育動物模型。輻射處理動物睪丸組織，可使生精細(xì)胞及精子DNA鏈發(fā)生斷裂，同時生精小管的正常結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，繼而影響生精功能，與此同時，輻射干預(yù)加強(qiáng)了促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，加速精子死亡［5］。體外X射線（4Gy）輻射或體內(nèi)植入同位素In-114（1.85MBq）污染的俄歇電子，兩種形式的輻射均能造成輸精管內(nèi)精子數(shù)目和睪丸重量的顯著降低，其中In-114的效果更明顯［6］。最新研究發(fā)現(xiàn)利用2.45 Hz微波照射20周齡成年小鼠后，其精子數(shù)量及活力顯著降低，表現(xiàn)為生精小管直徑縮短以及曲細(xì)精管變性，睪丸內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)增加［7］。

2 化學(xué)因素

2.1 棉酚

棉酚是草棉、樹棉或陸地棉成熟種子、根皮中提取的一種多元酚類物質(zhì)。有研究表明棉酚能夠?qū)踊盍σ约懊芏仍斐捎绊懀?］。口飼粗棉籽油能夠使小鼠體內(nèi)游離棉酚劑量達(dá)到14 mg／kg，產(chǎn)生對睪丸的生殖毒性［9］。腹腔內(nèi)注射劑量為5、10、20 mg／kg的棉酚溶液后，發(fā)現(xiàn)大鼠的精子活力及密度顯著降低，支持細(xì)胞自身毒性加強(qiáng)，加速曲細(xì)精管變性，大劑量同時能夠影響小鼠肝的正常功能［10］。在造模時應(yīng)注意棉酚對模型肝功能的損害，選擇未觀察到不良影響的最佳劑量為宜。

2.2 腺嘌呤

腺嘌呤是通過誘發(fā)慢性肝、腎功能損害建立動物模型的常用藥物，可造成雄性大鼠睪丸生精功能障礙，因此腺嘌呤大鼠不育癥動物模型為當(dāng)今不育癥藥效學(xué)及藥理學(xué)研究的常見模型之一。以200mg／kg腺嘌呤灌胃30d，觀察發(fā)現(xiàn)服用腺嘌呤后大鼠的精子總數(shù)及活力顯著降低，同時腺嘌呤能夠降低血清睪酮含量、抑制類固醇合成及睪丸內(nèi)皮素-1相關(guān)的m RNA表達(dá)［11］。但考慮到其具有較強(qiáng)肝腎毒性，應(yīng)選擇造模最佳劑量及時間。

2.3 雷公藤

雷公藤為衛(wèi)矛科植物雷公藤的根，其提取物雷公藤多苷能夠造成小鼠生殖功能損害。按劑量30 mg／kg口飼雷公藤多苷8周后，SD大鼠的精子密度、活力及精子內(nèi)Ca2＋濃度均顯著下降［12］。提示雷公藤提取物長期口飼喂養(yǎng)小鼠能夠成功建立動物不育模型?？紤]到雷公藤的藥物毒性，在利用雷公藤提取物造模時，應(yīng)選擇未損傷其他臟器的最佳劑量及時間。

2.4 烏本苷

烏本苷是在非洲或南美洲植物中發(fā)現(xiàn)的一種具有強(qiáng)心作用的甾體化合物，是 Na（＋）／K（＋）-ATP酶（鈉泵）的唯一天然抑制劑［13］。研究發(fā)現(xiàn)烏本苷能夠影響小鼠支持細(xì)胞內(nèi)支持 Na（＋）／K（＋）-ATP酶基因表達(dá)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)，劑量為1μM烏本苷干預(yù)會引發(fā)支持細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶和磷脂酰肌醇激酶／絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶磷酸化的增加，與此同時，烏本苷上調(diào)了支持細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)以及［甲基-（3）H］胸苷的摻入，繼而影響支持細(xì)胞正常生理功能，造成生精功能異常［14］。

2.5 甲醛

甲醛具有小鼠生殖細(xì)胞毒性，能夠?qū)π∈笊臣?xì)胞造成損傷。研究表明氣體甲醛吸入給藥（10 ppm／1h）35d后，小鼠睪丸內(nèi)睪酮含量、附睪精子濃度以及精子活力顯著下降，而精子畸形率升高［15］。最新研究發(fā)現(xiàn)，甲醛能夠加速小鼠睪丸組織的自噬作用，表現(xiàn)為睪丸重量和組織學(xué)改變，睪丸生精功能下降［16］。甲醛具有較強(qiáng)毒性，因此應(yīng)用甲醛建立模型的穩(wěn)定性及安全性有待更深層次的研究。

2.6 白消安

白消安主要應(yīng)用于治療惡性腫瘤，但長期服用可導(dǎo)致體內(nèi)沉積，抑制生殖干細(xì)胞分化，導(dǎo)致生殖功能異常［17］。研究表明單一腹腔注射劑量為5 mg／kg的白消安，就能夠使雄性小鼠生精功能發(fā)生異常，主要表現(xiàn)為睪酮分泌水平下降、睪丸體積縮小以及曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)發(fā)生變化［18］。當(dāng)劑量分別調(diào)節(jié)到15、30、45 mg／kg時，經(jīng)過4周白消安干預(yù)后，所有劑量組的小鼠生育力喪失，＞95%的精原干細(xì)胞在3 d內(nèi)消失，生育能力以及精原干細(xì)胞數(shù)量隨著時間增加可逐漸恢復(fù)，但是在高劑量白消安干預(yù)下恢復(fù)受到明顯抑制［19］。

3 內(nèi)分泌因素

3.1 己烯雌酚

己烯雌酚是人工合成的雌激素，能產(chǎn)生與天然雌二醇相同的藥理作用。研究表明己烯雌酚能夠抑制小鼠生殖功能。選擇剛出生的幼年雄性小鼠皮下注射100ng己烯雌酚，注射后小鼠睪丸內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞、生殖細(xì)胞以及多核細(xì)胞減少，同時影響下丘腦功能，導(dǎo)致內(nèi)分泌功能失調(diào)［20］。另有研究發(fā)現(xiàn)己烯雌酚能夠干擾小異源二聚體伙伴基因Nr0b2的表達(dá)，而該基因的表達(dá)能通過調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂以及睪酮合成來控制睪丸功能［21］。提示在己烯雌酚干預(yù)下能夠抑制小鼠睪丸生精，建立不育癥模型。

3.2 炔雌醚和左炔諾孕酮

左炔諾孕酮炔雌醚片為常用的有效避孕藥，應(yīng)用廣泛。其中主要成分為炔雌醚和左炔諾孕酮，兩者均為人工合成的激素類藥物。研究證實(shí)單獨(dú)使用炔雌醚或聯(lián)合應(yīng)用兩者的混合物均會對大鼠生殖功能造成損害，將SD大鼠按重量隨機(jī)分組，分別口飼0.33 mg／kg炔雌醚和0.67 mg／kg左炔諾孕酮以及同等劑量的兩種混合物，小鼠睪丸內(nèi)表現(xiàn)出畸形精子增多、拉長期精子細(xì)胞減少以及粗線期精母細(xì)胞分化阻滯［22］。

4 環(huán)境因素

環(huán)境化合物在日常生活中應(yīng)用廣泛，同時在生活環(huán)境中極易接觸，其具有較高生殖毒性，因此對于環(huán)境化合物的研究已引起學(xué)者們的廣泛關(guān)注，相關(guān)研究逐漸增多。

4.1 阿特拉津

阿特拉津的化學(xué)名為2-氯-4-二乙胺基-6-異丙胺基-1，3，5-三嗪，屬三氮苯類除草劑。研究表明阿特拉津可作為雄性小鼠的一種內(nèi)分泌干擾物，影響生殖功能［23］。將阿特拉津按照劑量50 mg／kg灌胃后，發(fā)現(xiàn)小鼠血清睪酮和睪丸內(nèi)睪酮含量均明顯減少50%；將小鼠體內(nèi)的間質(zhì)細(xì)胞與232 pg／ml阿特拉津溶液共同培養(yǎng)，間質(zhì)細(xì)胞中睪酮生成減少了35%［24］。近期研究發(fā)現(xiàn)，阿特拉津能夠降低發(fā)育期雄性小鼠睪丸細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽過氧化物酶、氧化氫酶的活性，同時抑制間質(zhì)細(xì)胞的雄核發(fā)育［25］。提示阿特拉津具有抑制睪丸生精作用，可作為不育癥造模的選擇之一。

4.2 甲氧滴滴涕

甲氧滴滴涕的化學(xué)名為1，1，1-三氯-2，2-二對甲氧苯基乙烷，屬有機(jī)氯殺蟲劑。口服后能干擾機(jī)體自身的激素分泌，導(dǎo)致生殖功能障礙［26］。通過甲氧滴滴涕的活性代謝產(chǎn)物2-（4-羥基苯基）-2-（4-甲氧基苯基）-1，1，1-三氯乙烷和2，2 -二 （4-羥基苯基）-1，1，1-三氯乙烷觀察甲氧滴滴涕的生殖毒性作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未觀察出不良反應(yīng)的合適劑量為每天0.6mg／kg，此劑量可損害小鼠生殖功能，同時畸形率未發(fā)生變化［27］。最新研究發(fā)現(xiàn)，在甲氧滴滴涕干預(yù)下成年大鼠睪丸早期間質(zhì)細(xì)胞的生成受到抑制，同時隨著時間增加血清睪酮含量下降，并且能夠抑制新生間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)PDGFB mRNA的表達(dá)［28］。

4.3 乙烯菌核利

乙烯菌核利的化學(xué)名稱為3-（3，5-二氯苯基）-5-乙烯基-5-甲基-2，4-噁唑烷二酮，可作為多種蔬菜水果、植物及草類的殺菌劑。其自身具有抗雄激素樣作用，通過與雄激素受體競爭影響正常雄激素分泌，繼而抑制睪丸生精功能［29］。將成熟的鯽魚培育在三種濃度（100、400、800μg／L）的乙烯菌核利溶劑中，發(fā)現(xiàn)其所產(chǎn)生的影響程度具有劑量依賴性，而抑制過程主要是通過干擾類固醇的生成降低精子質(zhì)量［30］。

4.4 雙酚A

雙酚A的化學(xué)名稱為2，2-二（4-羥基苯基）丙烷，為已知的具有抗雄激素樣化合物，能夠誘導(dǎo)雄性大鼠不育［26］。按照劑量為0.0005～5 mg／kg喂養(yǎng)成年大鼠8周，此濃度的雙酚A未產(chǎn)生全身毒性反應(yīng)以及明顯的血清激素水平改變，但明顯減少曲細(xì)精管內(nèi)上皮細(xì)胞的高度和圓細(xì)胞的數(shù)量以及精子數(shù)量，抑制雄激素受體以及精子外部致密纖維蛋白相關(guān)基因的表達(dá)［31］。另有研究發(fā)現(xiàn)，分別用劑量0、20和40μg／（kg·day）的雙酚 A干預(yù)出生21、35、49d的幼年雄鼠，5周后小鼠睪丸內(nèi)雌激素受體α表達(dá)增加，生殖細(xì)胞有絲分裂減慢，精子密度及質(zhì)量下降，但并不影響生殖細(xì)胞印跡基因的甲基化［32］。

5 遺傳因素

越來越多的證據(jù)表明，許多情況下的男性不育癥是由基因缺陷所引起［33］。近年來越來越多有關(guān)男性不育癥的實(shí)驗(yàn)研究圍繞該方面展開。通過影響基因表達(dá)來建立男性不育癥動物模型越來越受到研究者重視。

5.1 磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶基因敲除

細(xì)胞內(nèi)的磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶（GPx4）能夠直接減少過氧化磷脂，具有較強(qiáng)的抗氧化作用。將小鼠睪丸精母細(xì)胞內(nèi)GPx4基因特異性敲除后，雄性小鼠附睪上分離的無GPx4精子無法與卵母細(xì)胞在體外結(jié)合，表現(xiàn)為前向運(yùn)動能力下降以及線粒體膜電位降低，繼而出現(xiàn)如精子中段發(fā)夾樣鞭毛彎曲和線粒體膨大等精子異常結(jié)構(gòu)［34］。提示特異性敲除雄性小鼠精子內(nèi)GPx4后表現(xiàn)為活動力嚴(yán)重下降，同時精子畸形率顯著提高。

5.2 雄激素受體基因敲除

雄激素和雄激素受體對睪丸發(fā)揮正常功能起著重要的作用，敲除小鼠睪丸細(xì)胞的雄激素受體后表現(xiàn)為生殖細(xì)胞發(fā)育遲緩以及血清睪酮水平降低，繼而導(dǎo)致不育。特異性敲除小鼠睪丸管周肌樣細(xì)胞中雄激素受體基因后，小鼠睪丸呈萎縮狀態(tài)，生殖細(xì)胞總數(shù)減少，支持細(xì)胞內(nèi)某些基因不能完全表達(dá)［35］。提示特異性敲除小鼠睪丸管周肌樣細(xì)胞中雄激素受體基因，可使支持細(xì)胞功能異常，小管周圍細(xì)胞收縮力減弱，影響正常精子發(fā)生和排出，導(dǎo)致小鼠不育。

6 小結(jié)

男性不育癥是由多種疾病和（或）因素造成的結(jié)果，有高達(dá)30%～40%的患者為不明原因［1］，給臨床治療帶來了極大的挑戰(zhàn)，也推動了眾多的臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。因此相關(guān)的造模方法也有很多種，目前主要分為物理因素、化學(xué)因素、內(nèi)分泌因素、環(huán)境因素、遺傳因素等。使用最廣泛的為化學(xué)因素，其優(yōu)勢是成功率高、費(fèi)用低、造模所需時間短，但也存在不足，如應(yīng)用化學(xué)藥品可能對肝、腎及其他臟器造成損害，形成多臟器損傷的疾病模型，直接影響模型的生物穩(wěn)定性。而且部分化學(xué)藥物的使用劑量在相關(guān)文獻(xiàn)中不統(tǒng)一，存在重復(fù)性差的現(xiàn)狀。物理方法對于生殖系統(tǒng)的損傷針對性較強(qiáng)，但生殖功能受到損害后極易恢復(fù)，模型穩(wěn)定性較差，并且干預(yù)手段的最佳劑量及時間很難定量。內(nèi)分泌因素模型給藥途徑與化學(xué)方法相似，但研究數(shù)據(jù)較少，因此有待更多相關(guān)方面的動物實(shí)驗(yàn)研究。目前關(guān)于環(huán)境化合物的基礎(chǔ)研究越來越多，大量研究發(fā)現(xiàn)許多人工合成并廣泛應(yīng)用于工業(yè)及農(nóng)業(yè)的有機(jī)化合物均具有較強(qiáng)的生殖毒性，其作用機(jī)理與化學(xué)因素和內(nèi)分泌因素相似，但相關(guān)研究數(shù)據(jù)亦較少，考慮到其較強(qiáng)致癌性，劑量、造模時間及給藥途徑仍有待研究。近年來生精相關(guān)基因研究成為生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)，據(jù)報(bào)道有超過2300組基因在睪丸中表達(dá)，其中有相當(dāng)多的基因影響人類的生殖功能并能導(dǎo)致男性不育癥的發(fā)生［36］，因此基因?qū)W將成為未來生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。但基于生精基因造模的操作難度大，尚不能廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究。綜上所述，目前化學(xué)方法為主要造模手段，隨著研究的深入以及造模方法的不斷改進(jìn)，環(huán)境化合物造模以及基因造模或許將代替化學(xué)方法，成為未來不育癥動物實(shí)驗(yàn)的主要造模方法。

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