徐澤彪,胡珍淵,方永軍,王首杰

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,陜西 咸陽712000；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安710038)

膠質(zhì)瘤具有復(fù)發(fā)率高、生存率低、侵襲性強(qiáng)的特點(diǎn)，是高度惡性的顱內(nèi)腫瘤，多數(shù)患者治療效果不佳，嚴(yán)重威脅著人們的健康[1]。因其與正常腦組織無明顯界限，且呈指狀向腦組織外破壞腦組織，常規(guī)切除術(shù)療效不佳，且高度惡性的膠質(zhì)瘤對(duì)放化療敏感性差，因此尋找新的治療靶點(diǎn)成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[2-3]。最近的研究表明，環(huán)狀RNA在神經(jīng)組織中含量更加豐富，其在神經(jīng)元的發(fā)育、增殖、腫瘤及其他疾病發(fā)生中扮演著重要的角色[4-5]。如在缺血性腦卒中模型中circDLGAP4作為miR-143的海綿，其表達(dá)水平的降低能抑制miR-143的功能，增加circDLGAP4的表達(dá)量可減輕腦損傷[6-8]；circZNF292通過調(diào)控細(xì)胞間Wnt信號(hào)，影響細(xì)胞的增殖，進(jìn)而參與影響腫瘤組織的血管生成[9-10]；has-circ-0037251是由METRN基因的多個(gè)外顯子組成的環(huán)狀RNA，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和分化中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。此外，研究表明has-circ-0037251通過發(fā)揮miR-1229-3p海綿和調(diào)節(jié)mTOR的表達(dá)作用促進(jìn)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展，而敲除has-circ-0037251基因則能促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，并誘導(dǎo)G1期阻滯[11]。目前，對(duì)于has-circ-0037251在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平還缺乏分析,尤其針對(duì)其在臨床診治中的意義還未得到充分研究。因此本研究結(jié)合臨床隨訪數(shù)據(jù),主要探討has-circ-0037251在膠質(zhì)瘤患者中的表達(dá)水平及與患者預(yù)后、臨床病理特征的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性分析2011年7月至2014年12月于空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)外科行膠質(zhì)瘤切除術(shù)的患者56例為膠質(zhì)瘤組，其中男24例，女32例，中位年齡為51歲，以上腫瘤組織標(biāo)本中WHO Ⅰ級(jí)20例，WHO Ⅱ級(jí)15例，WHO Ⅲ級(jí)8例，WHO Ⅳ級(jí)13例。標(biāo)本來源于醫(yī)院日常收集的膠質(zhì)瘤組織，患者的臨床病理數(shù)據(jù)是先前對(duì)患者的定期隨訪收集獲得。對(duì)照組腦組織取自腦出血或外傷需要接受開顱手術(shù)的患者，共30例，其中男15例，女15例，中位年齡為40歲。組織標(biāo)本取出后即在液氮中冷凍，后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱內(nèi)?；颊卟±Y料完整，術(shù)前均未進(jìn)行放療、化療、手術(shù)，并且未進(jìn)行靶向治療等其他新型治療手段。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合《赫爾辛基宣言》，研究對(duì)象或家屬均簽署了知情同意書。

1.2 檢測(cè)方法 將凍存的組織從-80 ℃冰箱取出，首先脫蠟處理腦組織標(biāo)本，隨后加入TRIzol試劑從組織標(biāo)本中提取RNA。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度，OD260/280在1.8～2.0之間為合格。使用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書操作，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行熒光定量PCR 技術(shù)(qRT-PCR)反應(yīng)，將GAPDH設(shè)為內(nèi)參，其引物序列為上游5’- GCACCGTCAAGGCTGAGAAC -3’，下游5’- TGGTGAAGACGCCAGTGGA -3’;人has-circ-0037251引物序列為：上游5’-CTGCTTTGGAGGTGATGGGGAC-3’,下游5’- GGGAGTCGGGGCTCTCAC -3’。采用2-△△Ct法計(jì)算has-circ-0037251的相對(duì)表達(dá)量。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行繪圖和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間患者臨床病理指標(biāo)的比較采用卡方檢驗(yàn)；生存率分析采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并進(jìn)行Log-Rank檢驗(yàn)；采用單因素和多因素Cox回歸分析法評(píng)價(jià)影響患者預(yù)后的臨床因素，主要包括年齡、性別、KPS評(píng)分、WHO分級(jí)、腫瘤大小、腫瘤分化程度，評(píng)估has-circ-0037251表達(dá)量對(duì)患者預(yù)后差異的影響。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 膠質(zhì)瘤組織中has-circ-0037251的表達(dá)水平 qRT-PCR結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，膠質(zhì)瘤組中的has-circ-0037251存在過表達(dá)現(xiàn)象[對(duì)照組(1.000±0.1756)與膠質(zhì)瘤組織(3.913±0.2589),P<0.05]，且has-circ-0037251表達(dá)量與WHO分級(jí)呈正相關(guān)[WHO Ⅰ-Ⅱ級(jí)(2.429±0.1987)與WHO Ⅲ-Ⅳ級(jí)(4.628±0.3050)，P<0.05]，高水平表達(dá)has-circ-0037251的膠質(zhì)瘤具有更高的WHO分級(jí)。見圖1。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05;與Ⅰ-Ⅱ級(jí)比較，△P<0.05

2.2 has-circ-0037251在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 計(jì)算膠質(zhì)瘤患者h(yuǎn)as-circ-0037251表達(dá)水平的平均值，以此將膠質(zhì)瘤患者分為has-circ-0037251高表達(dá)組(24例)和低表達(dá)組(32例)。通過對(duì)患者臨床病理特征的比較，發(fā)現(xiàn)has-circ-0037251的表達(dá)水平與WHO分級(jí)和KPS評(píng)分有關(guān)系(均P<0.05),而與年齡、性別、腫瘤大小等無關(guān)(均P>0.05)。見表1。

表1 has-circ-0037251表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.3 生存分析 隨訪期間，記錄患者生存情況。然后根據(jù)Kaplan-Meier法分析has-circ-0037251表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)has-circ-0037251低表達(dá)的患者生存時(shí)間更長，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0396)。因此，has-circ-0037251的表達(dá)量可作為判斷膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志。見圖2。

圖2 高h(yuǎn)as-circ-00372517表達(dá)組和低has-circ-0037251表達(dá)組生存率比較

2.4 膠質(zhì)瘤患者預(yù)后單因素和多因素分析 采用比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行單因素和多因素分析，結(jié)果表明：WHO分級(jí)、KPS評(píng)分、has-circ-0037251表達(dá)水平與患者總生存率相關(guān)，且高WHO分級(jí)、KPS評(píng)分<80、has-circ-0037251的高表達(dá)量是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表2。

表2 患者臨床病理特征和has-circ-0037251表達(dá)的單因素和多因素分析表

3 討 論

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)的高度惡性的腫瘤，其增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，造成患者預(yù)后不良，術(shù)后極易復(fù)發(fā)[12-13]。近年來對(duì)膠質(zhì)瘤的研究不斷深入，但關(guān)于其基因調(diào)控、發(fā)生發(fā)展、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等復(fù)雜的分子機(jī)制尚未完全闡明，如何改善患者預(yù)后，尋求理想的特異性腫瘤標(biāo)志物對(duì)膠質(zhì)瘤的診療有重要意義。

越來越多的的研究表明環(huán)狀RNA與神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤的發(fā)生有密切聯(lián)系，諸多文獻(xiàn)報(bào)道環(huán)狀RNA參與了膠質(zhì)瘤的發(fā)生和惡性發(fā)展過程[14]。circ-0001730參與激活wnt/β-catenin通路，促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖，侵襲和遷移[15]。Li等[16]發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤中has-circ-0007534通過發(fā)揮miR-761海綿的作用，調(diào)節(jié)ZIC5基因的表達(dá)，提示has-circ-0007534/miR-761/ZIC5調(diào)控環(huán)有望成為新的治療靶點(diǎn)。此外,表皮生長因子受體(EGFR)來源的has-circ-0080229可通過結(jié)合ANXA2等RNA結(jié)合蛋白，促進(jìn)膠質(zhì)瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。然而到目前為止，有關(guān)膠質(zhì)瘤與環(huán)狀RNA的研究還不足以應(yīng)用于臨床，此領(lǐng)域有待我們進(jìn)行更深層次的探索。

本研究選取了與膠質(zhì)瘤相關(guān)的一種環(huán)狀RNA——has-circ-0037251，探究其在膠質(zhì)瘤的診療、預(yù)后判斷方面的作用。研究發(fā)現(xiàn)，與正常腦組織相比，膠質(zhì)瘤患者的has-circ-0037251表達(dá)水平顯著上調(diào)，在探究has-circ-0037251表達(dá)水平與患者臨床病理指標(biāo)相關(guān)性時(shí)發(fā)現(xiàn)，WHO分期、KPS評(píng)分與has-circ-0037251的表達(dá)顯著相關(guān)，這提示has-circ-0037251可能與膠質(zhì)瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，抑制has-circ-0037251表達(dá)有逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展的可能，這一點(diǎn)在小鼠體內(nèi)已得到證實(shí)。Cao等[11]研究發(fā)現(xiàn)敲除has-circ-0037251可使腫瘤體積變小、重量減輕，延長小鼠生存期。然而，更有效、更準(zhǔn)確、更特異的RNA干擾方法，尤其是能安全作用于人體的方案仍有待探索和研究。Kaplan-Meier法生存率分析表明，has-circ-0037251高表達(dá)組的生存時(shí)間低于低表達(dá)組，最后對(duì)患者的預(yù)后分析顯示W(wǎng)HO分級(jí)、KPS評(píng)分、has-circ-0037251表達(dá)水平是影響患者生存率的主要因素，而高WHO分級(jí)、KPS評(píng)分<80、has-circ-0037251高表達(dá)可作為膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后獨(dú)立因素。本研究結(jié)果為膠質(zhì)瘤早期診斷、治療和及早干預(yù)提供了參考依據(jù)。

綜上所述，has-circ-0037251很有希望作為膠質(zhì)瘤診斷和預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物，另外，has-circ-0037251能否在其他病理過程中起作用，能否尋找到一種有效干預(yù)RNA的手段以及has-circ-0037251能否人體內(nèi)作為治療靶點(diǎn)都有待于進(jìn)一步的深入研究。