文 屏 王建文 蔡珊珊

1.深圳市藥品檢驗所，深圳 518057；2.廣東藥學(xué)院，廣州 510006

UPLC法測定九味肝泰膠囊中人參皂苷Rg1及三七皂苷R1的含量

文 屏1王建文1蔡珊珊2

1.深圳市藥品檢驗所，深圳 518057；2.廣東藥學(xué)院，廣州 510006

目的 建立九味肝泰膠囊中人參皂苷Rg1及三七皂苷R1的含量測定方法，彌補該品種質(zhì)量標準的不完善之處。 方法 采用ACQUITY BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色譜柱；流動相為乙腈-水，梯度洗脫；流速為0.4 ml/min；檢測波長為203 nm；柱溫為35℃；進樣體積為1 μl。 結(jié)果 人參皂苷Rg1及三七皂苷R1分別在0.10～1.50 mg/ml，0.04～0.60 mg/ml濃度范圍內(nèi)線性良好，平均回收率分別為99.4%、101.8%，RSD分別為0.5%、1.3%。 結(jié)論 該法方便、快速、準確，適用于九味肝泰膠囊中人參皂苷Rg1及三七皂苷R1的含量測定，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

超高效液相色譜法；人參皂苷Rg1；三七皂苷R1；含量測定；質(zhì)量控制

三七（Panax Notoginseng（Burk.）F.H.Chen）為五加科人參屬植物，具有顯著的活血化瘀、消腫止痛的功效，其主要活性成分為人參皂苷Rg1及三七皂苷R1，具有顯著的抗炎活血作用[1-3]，被廣泛應(yīng)用于各種中成藥中。2010年版《中華人民共和國藥典》（簡稱“中國藥典”）及其他相關(guān)文獻均以人參皂苷Rg1和三七皂苷R1作為三七質(zhì)量控制的指標成分[4-5]。為保證產(chǎn)品質(zhì)量，有必要對中藥成方制劑中人參皂苷Rg1及三七皂苷R1的含量進行質(zhì)量控制，建立準確、可靠的檢驗方法。九味肝泰膠囊收載于《中成藥地方標準》上升國家標準內(nèi)科肝膽分冊[6]。由三七、郁金、蒺藜、姜黃、大黃、黃芩、蜈蚣、山藥和五味子等9味中藥組成，具有化瘀通絡(luò)、疏肝健脾的作用，能治療慢性乙型肝炎及HBV攜帶者，能盡快改善癥狀，恢復(fù)體征，改善肝臟微循環(huán)，阻斷肝病慢性化發(fā)展，促進肝功能的恢復(fù)[7-8]?，F(xiàn)行標準主要涉及3個鑒別項目，分別是三七藥材、大黃（大黃素及大黃酚）、黃芩（黃芩苷）有關(guān)成分的鑒別以及大黃素含量測定項。目前，九味肝泰膠囊僅有關(guān)于大黃素、姜黃素以及黃芩苷等3個成分的HPLC含量測定的文獻報道[9-11]，此外，還有采用TLC法對九味肝泰膠囊中的五味子醇甲進行含量測定的報道[12]。目前全國共有2個生產(chǎn)廠家，2個藥品批準文號。生產(chǎn)廠家均按現(xiàn)行標準檢驗。目前該藥品的質(zhì)量標準中對于三七藥材僅建立了鑒別項目，尚無含量測定質(zhì)控項目。中國藥典2010年版一部對三七藥材中有效成分人參皂苷Rg1和三七皂苷R1的含量測定方法采用HPLC，但檢測時間比較長。為了提高本品的質(zhì)量控制標準，建立更加快速、高效的控制三七藥材投料情況的含量測定方法，本研究采用超高效液相色譜法（ultra performance liquid chromatography，UPLC） 對該藥品中的人參皂苷Rg1及三七皂苷R1定量分析方法進行了研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters ACQUITY UPLC超高液相色譜儀 （包括二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、PDA檢測器及Empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，美國Waters公司生產(chǎn)）。METTLER-TOLEDO XS205電子分析天平 （十萬分之一，瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 試藥

人參皂苷Rg1對照品 （中國食品藥品檢定研究所，批號為：110704-201223，含量以93.4%計算，供含量測定用）；三七皂苷R1對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110745-200617，供含量測定用）。九味肝泰膠囊 （湖南省新匯制藥有限公司，批號：120701、120702）；三七陰性藥材（按九味肝泰膠囊處方制備）；乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITYBEHC18（2.1mm×50mm，1.7μm）；流動相：乙腈-水梯度洗脫（0～2 min：80%水；2～12 min：80%→81%水）；流速：0.4 ml/min；檢測波長：203 nm；柱溫：35℃；進樣量：1 μl。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取人參皂苷Rg1對照品約0.01 g，精密稱定，置于10 ml容量瓶中，取三七皂苷R1對照品約0.01 g，精密稱定，置于50 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度。用2 ml移液管轉(zhuǎn)移至20 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得人參皂苷Rg1和三七皂苷R1混合對照品液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取樣品約0.5 g，精密稱定。精密加入甲醇25 ml，稱定重量，加熱回流1 h，放冷后稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻后濾過，精密取濾液10 ml，濾液蒸干，用15 ml水溶解，用乙醚萃取3次，每次30 ml，棄去乙醚層。用水飽和正丁醇萃取3次，每次30 ml，合并正丁醇液，正丁醇液用氨試液洗滌3次，每次30 ml，棄去堿水層，正丁醇液再用正丁醇飽和水洗滌3次，每次30 ml，分取正丁醇液，回收蒸干，殘渣用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過（用 0.22 μm 濾膜），取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按制備過程取除三七外的其余藥材，制成缺三七陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

分別取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各1 μl進樣，記錄色譜圖，結(jié)果顯示，供試品色譜圖中三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的色譜峰能與其他成分很好地分離，分離度均＞1.5，理論塔板數(shù)按三七皂苷R1峰計算＞4000，陰性樣品溶液在三七皂苷R1、人參皂苷Rg1色譜峰處均無干擾（圖1）。

2.4 線性關(guān)系考察

圖1 九味肝泰膠囊UPLC圖A.對照品；B.供試品；C.陰性樣品；1.三七皂苷 R1；2.人參皂苷 Rg1

分別精密吸取混合對照品溶液 0.2、0.5、1、2、3 μl，注入超高效液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件測定峰面積，以色譜峰峰面積（Y）為縱坐標，進樣量（X）為橫坐標繪制標準曲線，得到兩種成分的回歸方程。其中，人參皂苷 Rg1回歸方程 Y=7.12×105X+1.39×104，r=0.9999；三七皂苷 R1回歸方程 Y=6.47×105X+5.48×103，r=0.9999。 表明人參皂苷 Rg1在 0.10～1.50 mg/ml，三七皂苷R1在0.04～0.60 mg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

精密吸取人參皂苷Rg1、三七皂苷R1混合對照品溶液 1 μl，按“2.1”項下色譜條件操作，重復(fù)進樣 6次。記錄人參皂苷Rg1、三七皂苷R1的峰面積，其RSD值分別為0.4%、0.3%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取供試品溶液（批號：120702）1 μl，分別于 0、4、8、10、24 h 進樣測定，計算各成分含量的 RSD值。結(jié)果提示，人參皂苷Rg1、三七皂苷R1的RSD值分別為1.0%、0.2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一批樣品（批號：120702）6份，分別精密稱定，按“2.2”項下方法制備和“2.1”項下色譜條件測定，計算人參皂苷Rg1和三七皂苷R1的含量，結(jié)果提示，人參皂苷Rg1、三七皂苷R1的RSD分別為1.7%和2.2%。

2.8 加樣回收率試驗

稱取已知含量的九味肝泰膠囊 （批號：120702，含人參皂苷Rg1和三七皂苷R1分別為4.23、0.84 mg/g）6份，每份約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入一定量的混合對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備和“2.1”項下色譜條件測定，并計算各組分回收率，結(jié)果提示，人參皂苷Rg1、三七皂苷R1的平均回收率分別為99.4%、101.8%，RSD分別為0.5%、1.3%（表1）。

表1 加樣回收率實驗結(jié)果

2.9 樣品含量測定

分別取相同廠家共 2批樣品（批號：120701、120702），按“2.2.2”項下方法制備和“2.1”項下色譜條件測定，以外標法進行定量，計算三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（mg/g）

3 討論

3.1 提取溶劑和量的選擇

九味肝泰膠囊屬于復(fù)方中藥制劑，處方含有九味中藥，如直接用甲醇等試劑提取，供試品成分較多，干擾嚴重，必須建立一個合適的提取方法。本試驗提取方法是基于皂苷提取通則的基礎(chǔ)上，再加以補充而展開的。供試品制備方法即用甲醇溶劑加熱回流后，濾液用乙醚等極性小的有機溶劑脫脂、然后用水飽和的正丁醇萃取，再用氨試液洗滌除雜[13]，棄除黃酮類苷元等雜質(zhì)，對干擾成分如糖類等可采用加正丁醇飽和的水洗滌的方法除去。本研究在提取過程中進行了比較，沒有進行乙醚脫脂這一過程時，雜峰干擾嚴重，后對提取方法進行改進，用乙醚萃取脫脂后，雜質(zhì)峰干擾少，分離效果較好。

試驗過程中發(fā)現(xiàn)樣品用甲醇提取加熱回流后，精密量取10 ml的濾液和全部濾液蒸干的提取效果不同，前者較后者雜質(zhì)峰較少，分離效果較好。

3.2 提取方法的選擇

本研究分別對索氏提取、大孔樹脂D101和加熱回流提取三種提取方式進行考察。參考相關(guān)文獻[14-15]，大孔吸附樹脂有較強的吸附色素等雜質(zhì)的能力，可分離得到有效成分，能夠達到去粗取精的目的，但對被測成分有損失且耗費時間長。索氏提取對于沸點較低溶劑如乙醚的提取率較高，但操作復(fù)雜。最終考察結(jié)果顯示索氏提取、大孔樹脂D101和加熱回流提取效果幾乎相同，故本試驗最終采用簡便且提取率高的加熱回流方法提取。

[1]華聲瑜，曲鳳，陳麗平，等.人參皂苷Rg1對血小板聚集及環(huán)磷腺苷的影響[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，31（1）：31-33.

[2]蘇華，何飛，邱宏聰，等.三七皂苷R1在抗凝血酶參與下對體外凝血酶活性的影響[J].中國輸血雜志，2013，26（2）：191-194.

[3]趙保勝，桂海水，徐暾海.人參皂苷Rg1抗炎作用實驗研究[J].人參研究，2010，（4）：2-4.

[4]劉長青，何百寅，賴小平，等.HPLC測定經(jīng)絡(luò)貼巴布劑中 3 種皂苷的含量[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報，2010，26（6）：590-594.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：1-12.

[6]國家中成藥標準江編·中成藥地方標準上升國家標準部分·內(nèi)科肝膽分冊[Z].2002：132.

[7]鄧立記.九味肝泰膠囊與阿德福韋酯片聯(lián)合治療乙型肝炎后早期肝硬化的療效分析[J].臨床醫(yī)學(xué)工程，2011，18（7）：1022-1023.

[8]季雪良，常峰，金鳳，等.九味肝泰膠囊聯(lián)合恩替卡韋治療慢性乙型肝炎臨床研究[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2013，23（4）：203-205.

[9]熊建文，張群，吳燦.高效液相色譜法測定九味肝泰膠囊中大黃素含量[J].中南藥學(xué)，2003，1（4）：234-236.

[10]鄭冰珊，陳曉城.高效液相色譜法測定九味肝泰膠囊中黃芩苷含量[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008，32（5）：677-678.

[11]葉優(yōu)苗，張建方，陳宗良.高效液相色譜法測定九味肝泰膠囊中姜黃素含量[J].中國藥業(yè)，2003，22（11）：41-42.

[12]蔡步林，王艷，丁野，等.九味肝泰膠囊質(zhì)量標準的研究[J].中國藥師，2012，15（10）：1442-1444.

[13]李劍鋒，晏亦林.反相高效液相色譜法測定健脾固表顆粒中人參皂苷 Rg1、Re 的含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2006，25（6）：573-574.

[14]龍彥綱，黃曉其，林榮鋒，等.HPLC法同時測定三芎止痛膏中三七皂苷和人參皂苷的含量[J].中國新藥與臨床藥理，2008，19（1）：56-58.

[15]黃曉其，曾寶，蘇子仁.高效液相梯度法測定紅花牡丹膏中人參皂苷 Rg1、Rb1、Re及三七皂苷 R1的含量[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2007，27（10）：1393-1396.

Determination of ginsenoside Rg1and notoginsenoside R1in Jiuweigantai capsule by UPLC

WEN Ping1WANG Jian-wen1CAI Shan-shan2
1.Shenzhen Institute for Drug Control in Guangdong Province,Shenzhen 518057,China;2.Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China

ObjectiveTo establish an UPLC method for the content determination of ginsenoside Rg1and notoginsenoside R1in Jiuweigantai capsule.MethodsACQUITY BEH C18analytical column(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)was used with the mobile phase consisting of acetonitrile-water in gradient elution at a flow rate of 0.4 ml/min.The detection wavelength was 203 nm,column temperature was 35℃,and injection volume was 1 μl.ResultsGinsenoside Rg1and notoginsenoside R1in Jiuweigantai capsule had good linearity within the range of 0.1-1.5 mg/ml and 0.04-0.6 mg/ml respectively,and their recoveries were 99.4%,101.8%,with RSD of 0.5%,1.3%respectively.ConclusionThe method is convenient,quick,correct for determination of ginsenoside Rg1and notoginsenoside R1in Jiuweigantai capsule,and can be used for the quality control for Jiuweigantai capsule.

Ultra performance liquid chromatography;Ginsenoside Rg1;Notoginsenoside R1;Content determination;Quality control

R927.2

A

1674-4721（2014）04（a）-0009-04

文屏（1982-），女，碩士，主管藥師，研究方向：中藥有效成分及中藥分析

2014-01-09 本文編輯：袁 成）