大孔樹脂法純化錦燈籠宿萼總黃酮的工藝

王曉林，薛健飛，陳 帥，王慧竹，鐘方麗

（吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022）

錦燈籠（Physalis alkekengi L.var.franchetii (Mast.)Makino）又名酸漿、紅姑娘、燈籠草，屬茄科植物酸漿的干燥宿萼或帶果實的宿萼。錦燈籠全草及果實均可入藥，具有清熱解毒、利咽、化痰、利尿作用，用于咽痛音啞、痰熱咳嗽、小便不利，其果實營養(yǎng)較豐富，果實果紅素可作食品著色劑。錦燈籠含有酸漿苦素類化合物、甾醇類、生物堿、氨基酸、黃酮類化合物和豐富的礦物元素及維生素[1-3]。已有學(xué)者對錦燈籠的化學(xué)成分進(jìn)行了相關(guān)研究，結(jié)果表明酸漿苦素類化合物、黃酮類化合物是其主要的功效成分[4-6]。黃酮類化合物是一類重要的天然有機化合物，具有抗癌、抗心腦血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌抗病毒、抗氧化和清除自由基等生理活性[7-10]，廣泛用于醫(yī)藥和食品領(lǐng)域。大孔吸附樹脂是一種多孔性、高比表面積高分子材料，對天然植物提取液中有機物質(zhì)具有選擇性吸附作用，在天然產(chǎn)物活性成分的分離純化有廣泛應(yīng)用[11-12]。本實驗對D-101型大孔吸附樹脂純化錦燈籠宿萼總黃酮的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期研究結(jié)果能為錦燈籠宿萼的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

錦燈籠宿萼 安徽省亳州市華申藥業(yè)有限公司；蘆丁對照品 中國食品藥品檢定研究院；水為重蒸餾水；大孔吸附樹脂（LSA-21、LSA-10、AB-8、LX-36、D-101、LSA-33） 西安藍(lán)曉科技有限公司；硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

752 N型紫外-可見分光光度計、JY2002型電子天平上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D型循環(huán)水真空泵 河南省鞏義市英峪儀器一廠；CS101-AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱 中國重慶實驗設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取蘆丁對照品（120℃干燥至質(zhì)量恒定）10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加入50%乙醇，制成蘆丁對照品溶液[13]（0.20 mg/mL）。精密吸取上述蘆丁對照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL分別置于50 mL容量瓶中，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[14-15]，回歸方程為A=12C－0.001 83，R=0.999 9，結(jié)果表明蘆丁在0.008～0.048 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

1.3.2 樣品含量測定

取樣品液、吸附后液和解吸液適量，分別置于25 mL容量瓶中，按1.3.1節(jié)方法，以不加供試品的平行樣為空白，于510 nm[16-17]波長處測定吸光度，計算樹脂對錦燈籠宿萼總黃酮的吸附率、解吸率及浸膏總黃酮含量。計算公式如下[18-19]：

式中：C0為起始樣品液中總黃酮質(zhì)量濃度/（mg/mL）；C1為吸附后溶液中總黃酮質(zhì)量濃度/（mg/mL）；C2為解吸液中總黃酮質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V1為樣品液體積/mL；V2為解吸液體積/mL；m1為解吸液干燥后固體的稱樣量/mg；m2為解吸液中總黃酮的測定量/mg。

1.3.3 大孔吸附樹脂的預(yù)處理

稱取大孔吸附樹脂LX-36、LSA-33、LSA-10、D-101、AB-8、LSA-21各50 g加入玻璃柱內(nèi)，按照文獻(xiàn)[20]進(jìn)行預(yù)處理，樹脂處理完成后，置于密閉容器中，備用。

1.3.4 錦燈籠宿萼總黃酮樣品液的制備

稱取干燥的錦燈籠宿萼粉末適量，于圓底燒瓶中加入8倍量80%的乙醇溶液，熱回流提取2次，每次3.0 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至相對密度為1.18～1.25（60℃），蒸餾水定容至容量瓶中，待用[21]。

1.3.5 大孔吸附樹脂純化錦燈籠宿萼總黃酮工藝條件的確定

根據(jù)前期6種樹脂對錦燈籠宿萼總黃酮純化的篩選試驗數(shù)據(jù)，選用D-101型樹脂進(jìn)行實驗。稱取2 g處理好的D-101型大孔吸附樹脂數(shù)份，分別置于數(shù)個干燥的100 mL具塞三角瓶中[22-24]，各加入20 mL已知質(zhì)量濃度的錦燈籠宿萼總黃酮樣品液，進(jìn)行吸附-解吸實驗，通過單因素試驗考察不同吸附時間（1、2、3、4、5、6、7 h）、樣品液不同pH值（4、5、6、7、8、9、10）對吸附率的影響，考察解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)（10%、30%、50%、70%、90%）、解吸液用量（30、40、50、60、70、80 mL）、解吸時間（1、3、5、7、9、24 h）、樣品液不同pH值（4、5、6、7、8、9、10）對解吸率的影響[25]，在單因素試驗基礎(chǔ)上，對上述影響錦燈籠宿萼總黃酮純化的因素進(jìn)行五因素四水平正交試驗，正交試驗因素水平如表1所示。

表1 正交試驗因素與水平Table1 Coded levels for independent variables used in orthogonal array design

1.3.6 工藝驗證實驗

稱取D-101型大孔吸附樹脂6 g，共3份，分別置于3個干燥的250 mL三角瓶中，同時分別吸取60 mL錦燈籠宿萼總黃酮樣品液（總黃酮質(zhì)量濃度為1.171 8 mg/mL），用5% NaOH溶液調(diào)pH值為10，然后加到250 mL三角瓶內(nèi)，振蕩吸附3 h，過濾，照1.3.1節(jié)的方法測定吸光度，計算吸附率。然后向過濾后帶有樹脂的3個三角瓶中各加入210 mL 80%的乙醇溶液，振蕩解吸7 h，按1.3.2節(jié)的方法測定溶液中總黃酮的含量，計算解吸率。再取50 mL總黃酮質(zhì)量濃度為1.171 8 mg/mL的錦燈籠總黃酮樣品液、上述解吸液200 mL倒入稱量后的蒸發(fā)皿中水浴蒸干，然后放入到電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥至質(zhì)量恒定，計算錦燈籠宿萼干浸膏質(zhì)量及浸膏中總黃酮的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 吸附時間對吸附率的影響

圖1 吸附時間對吸附率的影響Fig.1 Effect of adsorption time on adsorption rate

如圖1所示：隨著吸附時間的延長，吸附率逐漸升高，當(dāng)吸附時間達(dá)3 h，吸附率已達(dá)到了較高值，再延長吸附時間，吸附率基本不再提高，為了進(jìn)一步考察吸附時間對吸附率的影響，選擇吸附時間為2.5、3.0、3.5、4.0 h進(jìn)行正交試驗。

2.1.2 解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)對解吸率的影響

圖2 解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)對純化效果的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on purification efficiency

如圖2所示：隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，解吸率逐漸上升，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時，解吸率達(dá)到最高值，為了進(jìn)一步考察解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)對解吸率的影響，選擇解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%進(jìn)行正交試驗。

2.1.3 解吸液乙醇用量對解吸率的影響

圖3 解吸液乙醇用量對純化效果的影響Fig.3 Effect of ethanol amount on purification efficiency

如圖3所示：隨著解吸液乙醇用量的增大，解吸率逐漸增大，當(dāng)解吸液用量達(dá)到70 mL時，解吸率已達(dá)到較高值，再增加解吸液用量，解吸率增加較小，為了進(jìn)一步考察解吸液用量對解吸率的影響，選擇解吸液用量為60、65、70、75 mL進(jìn)行正交試驗。

2.1.4 解吸時間對解吸率的影響

圖4 解吸時間對純化效果的影響Fig.4 Effect of desorption time on purification efficiency

如圖4所示：隨著解吸時間的延長，解吸率逐漸升高，但當(dāng)解吸時間達(dá)到7 h時解吸率已達(dá)到較高水平，再延長解吸時間，解吸率增加幅度較小，為了進(jìn)一步考察解吸時間對解吸率的影響，選擇解吸時間為5、6、7、8 h進(jìn)行正交試驗。

圖5 樣品液pH值對純化效果的影響Fig.5 Effect of sample pH on purification efficiency

2.1.5 樣品液pH值的影響

如圖5所示：吸附率隨pH值的升高而增大，解吸率略有下降，當(dāng)樣品液pH值為7時，吸附率達(dá)到了77.58%，之后吸附率隨pH值的增大而緩慢提高，為了進(jìn)一步考察樣品液pH值的影響，選擇樣品液pH值為7、8、9、10進(jìn)行正交試驗。

2.2 正交試驗

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table2 Orthogonal array design and results

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對影響錦燈籠宿萼總黃酮在D-101型大孔吸附樹脂上吸附與解吸的主要因素樣品液pH值、吸附時間、解吸液體積、解吸時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)按五因素四水平進(jìn)行正交試驗，因素水平表見表1。稱取16份預(yù)處理好的D-101型大孔吸附樹脂，每份2 g， 分別置于16個干燥的100 mL具塞三角瓶中，各加入20 mL 1.181 3 mg/mL的錦燈籠宿萼總黃酮樣品液，用5% HCl溶液和5% NaOH溶液調(diào)pH值，然后進(jìn)行靜態(tài)吸附和解吸實驗，收集吸附后藥液和解吸液，按1.3.2節(jié)方法測定吸光度，計算吸附率和解吸率，結(jié)果見表2。

由表2可知，D-101型大孔吸附樹脂純化錦燈籠宿萼總黃酮的最佳工藝條件為樣品液pH 10、吸附時間3 h、解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、解吸液體積70 mL（體積為樹脂質(zhì)量的35倍）、解吸時間7 h。

2.3 工藝驗證實驗

為了檢驗正交試驗結(jié)果的可靠性，按優(yōu)化的工藝條件進(jìn)行3次驗證實驗，結(jié)果見表3。

表3 工藝驗證實驗結(jié)果Table3 Validation of the optimized purification conditions

由表3可知，3次驗證實驗的吸附率和解吸率分別為81.27%、82.42%、80.84%和86.26%、85.42%、87.16%，平均吸附率和解吸率分別為81.51%和86.28%，干浸膏中總黃酮含量由11.45%提高到45.56%。

3 結(jié) 論

對純化錦燈籠宿萼總黃酮的6種不同型號大孔吸附樹脂進(jìn)行了篩選，并通過單因素和正交試驗研究了D-101型大孔吸附樹脂純化錦燈籠宿萼總黃酮的工藝條件。結(jié)果表明，在錦燈籠宿萼提取液pH值為10、吸附時間3 h、解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、解吸液體積70 mL（體積為樹脂質(zhì)量的35倍）、解吸時間7 h條件下，D-101型大孔吸附樹脂純化錦燈籠宿萼總黃酮的吸附率和解吸率分別為81.51%和86.28%，純化后的干浸膏總黃酮含量由11.45%提高到45.56%。

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