楊靜娜，孫玉娣，關(guān) 毅

（天津大學(xué)化工學(xué)院，天津300072）

微生物燃料電池（M icrobial Fuel Cell，簡稱MFC）是指在微生物的催化作用下將有機(jī)物的化學(xué)能轉(zhuǎn)變成電能的裝置［1］。由于 MFC可以將各種有機(jī)質(zhì)直接轉(zhuǎn)化成電能，不僅能量轉(zhuǎn)化率高、無污染，而且在獲得電能的同時(shí)可以凈化廢水、廢物，消減或消除污染，MFC日益受到學(xué)術(shù)界的關(guān)注［2-4］。1910年英國植物學(xué)家Potter以葡萄糖為底物，酵母和大腸桿菌為產(chǎn)電微生物，在MFC中獲得了電壓［4］，此后，MFC在空間科學(xué)研究領(lǐng)域取得了較大進(jìn)展。MFC具有能源轉(zhuǎn)化效率高、燃料來源廣泛、反應(yīng)條件溫和、環(huán)保無污染等特點(diǎn)，成為極具希望緩解能源短缺問題的新技術(shù)。

日益增長的能源需求與環(huán)境危機(jī)促使人們關(guān)注可再生能源的發(fā)展［5-6］。微生物燃料電池在能量轉(zhuǎn)化過程中減少了燃燒步驟，使其轉(zhuǎn)化效率大大提高，具有很廣闊的應(yīng)用前景，研究者們已經(jīng)在其結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和提高輸出功率方面取得了很大進(jìn)展［7-12］。但是目前微生物燃料電池的電子回收率和電流密度都不高，因此選取高活性的微生物尤其重要［13］。乳酸菌作為產(chǎn)電微生物具備如下優(yōu)勢：來源廣泛，生長迅速；作為耐氧厭氧型，用其制成的MFC適用性廣泛；對人體與環(huán)境安全無害；遺傳背景較為清楚，便于機(jī)理研究。張鑫［14］等以乳酸菌為產(chǎn)電微生物，MFC的最大輸出電壓為637.2 mV，說明以乳酸菌為產(chǎn)電菌是可行的，具有良好效果。

MFC系統(tǒng)底物直接影響著產(chǎn)電能力［15］，葡萄糖是微生物新陳代謝不可缺少的碳源，其氧化反應(yīng)釋放的能量是微生物生命活動所需能量的重要來源［16］，因此選擇葡萄糖作為 MFC的底物。本研究采用1.5 g/L葡萄糖溶液作為陽極液，0.1 mol/L的鐵氰化鉀溶液作為陰極液，環(huán)境溫度為30℃。通過考察乳酸菌產(chǎn)電過程中pH值、陽極液中乳酸菌菌數(shù)、葡萄糖濃度、化學(xué)耗氧量（COD）、代謝產(chǎn)物（主要是醛、醇和酸類）的變化，并且設(shè)置空白對照實(shí)驗(yàn)即乳酸菌生物膜電極在非產(chǎn)電的情況（生物膜電極在單個(gè)瓶中進(jìn)行厭氧發(fā)酵），以此來分析乳酸菌產(chǎn)電的主要代謝過程。

微生物燃料電池的研究逐漸增多，在生物部分的研究包括產(chǎn)電微生物的選擇、產(chǎn)電微生物細(xì)胞內(nèi)的電子傳遞以及微生物與電極之間的電子傳遞機(jī)理等，其中產(chǎn)電微生物的生理學(xué)特性以及具體的產(chǎn)電機(jī)制的檢測存在一定困難。本實(shí)驗(yàn)選取高活性的乳酸菌作為產(chǎn)電微生物，首次以氣相色譜手段分析乳酸菌代謝產(chǎn)物的含量來判斷產(chǎn)電過程中乳酸菌的產(chǎn)電機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)裝置和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

本實(shí)驗(yàn)采用自制的雙室微生物燃料電池系統(tǒng)，它主要是由2個(gè)等容積的圓形玻璃反應(yīng)器（高10 cm，底面直徑6 cm）組成，有效體積為250 mL。反應(yīng)器間有管路連接，管路中間用4×4 cm2的N117質(zhì)子交換膜（上海河森電氣有限公司）將兩反應(yīng)器隔開，在使用之前要經(jīng)過消毒處理。電池系統(tǒng)的電極均采用經(jīng)處理后的碳紙電極（HCP030，上海河森電氣有限公司），電極尺寸為4×2.5 cm2。

1.2 菌種與運(yùn)行條件

微生物菌種取自某乳業(yè)污水，經(jīng)分離純化培養(yǎng)馴化后備用。菌種培養(yǎng)采用MRS培養(yǎng)基。MFC的陽極液由1.5 g/L的葡萄糖和磷酸鹽緩沖液組成，陰極液采用鐵氰化鉀溶液。陽極陰極pH值均調(diào)節(jié)到7.0。

1.3 分析與測試

1.3.1 M FC產(chǎn)電性能測試

在雙室微生物燃料電池系統(tǒng)中進(jìn)行乳酸菌MFC的啟動，首先將電極置于MRS培養(yǎng)液中放于4℃冰箱1周或以上使細(xì)菌形成的生物膜牢固附著于碳紙上，然后將乳酸菌的生物膜陽極放入微生物燃料電池反應(yīng)器中，陽極室加入COD為1.5 g/L的陽極液，進(jìn)行產(chǎn)電性能的實(shí)驗(yàn)。

MFC的產(chǎn)電性能通常以最大輸出功率密度來表示，待MFC系統(tǒng)穩(wěn)定后，將外阻在50～10000Ω區(qū)間內(nèi)逐漸增大，記錄在不同外阻條件下電池的輸出電壓，計(jì)算輸出功率。根據(jù)P=U2/R，當(dāng)R=r時(shí)，功率達(dá)到最大Pmax=U2/4r。由于微生物生長的電極面積會對產(chǎn)能產(chǎn)生影響，因此單位面積或體積產(chǎn)生的功率更能說明微生物產(chǎn)電的情況，本實(shí)驗(yàn)采用陽極面積功率密度，陽極面積為 A，計(jì)算公式如式（1）。

1.3.2 葡萄糖濃度和COD去除率的測定

葡萄糖濃度的測定：在氫氧化鈉和苯酚存在下，3，5-二硝基水楊酸（DNS）與還原糖在沸水浴中反應(yīng)生成3-氨基-5硝基水楊酸。在過量的氫氧化鈉堿性溶液中此化合物呈橘紅色，在540nm處有最大吸收峰，在一定的濃度范圍內(nèi)，還原糖的量與光吸收值呈線性關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)采用北京瑞利分析儀器公司的UV-9200紫外可見分光光度計(jì)在540nm波長下測定反應(yīng)生成物的吸光度，以此來確定底物葡萄糖的濃度。

COD去除率的測定：采用重鉻酸鉀法測定。

1.3.3 乳酸菌M FC代謝產(chǎn)物成分及含量的檢測

采用北京瑞利分析儀器公司生產(chǎn)的SP-2100氣相色譜儀，色譜柱為石英毛細(xì)管柱，分別用頂空氣相色譜法和甲酯化法測定代謝產(chǎn)物的含量。

1.3.3.1 頂空氣相色譜法測定乙醇及乙醛含量

色譜操作條件：柱溫40℃（0.21min）→90℃（3.00min）10℃/min，進(jìn)樣器 110℃，F(xiàn)ID檢測器：130℃。氮?dú)?10 mL/min，氫氣 10 mL/min，氧氣20 mL/min。

1.3.3.2 甲酯化法測定乙酸及乳酸含量

色譜操作條件：柱溫80℃（0.21min）→110℃（0.51min）10℃/min，110℃（0.21min）→210℃（0.51min）20℃/min進(jìn)樣器220℃，F(xiàn)ID檢測器：230℃。氮?dú)?10 mL/min，氫氣 10 mL/min，氧氣20 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 電壓和功率密度曲線

在室溫條件下，乳酸菌MFC以1.5 g/L葡萄糖為底物，圖1給出了電池的開路電壓隨時(shí)間的變化關(guān)系和乳酸菌MFC的功率密度曲線。

由圖1a）可以看出，乳酸菌在經(jīng)過1.8 d的適應(yīng)期開路電壓由820 mV降至500 mV，然后電壓雖然有一定程度的下降，但是仍處于相對穩(wěn)定的水平。在運(yùn)行7 d后由于底物葡萄糖的大量消耗，電壓明顯下降。待乳酸菌MFC系統(tǒng)運(yùn)行穩(wěn)定后，將外阻在50～10000Ω區(qū)間內(nèi)逐漸增大，記錄不同電阻下電池的電壓值，從而計(jì)算出不同外阻時(shí)電池的電流和功率密度。圖1b）是乳酸菌MFC的功率密度曲線。由圖1可知，功率密度隨電流的增大而增大，增至最大值后，電流進(jìn)一步增大，功率密度卻迅速降低。這是由于電流隨外部電阻的減小而增加，當(dāng)外部電阻減小到較小值，電流增加至較大值時(shí)，發(fā)生了近似短路的情況，導(dǎo)致輸出功率密度迅速降低。在該實(shí)驗(yàn)條件下，乳酸菌MFC在500Ω外阻條件下獲得393.23 mW/m2的最大輸出功率密度，即其內(nèi)阻約為500Ω。

圖1 乳酸菌MFC開路電壓a）和功率密度b）Fig.1 Open-Circuit voltage a）and power density b）of the lactic acid bacteria MFC

2.2 產(chǎn)電過程中各參數(shù)的情況對比

圖2是乳酸菌MFC產(chǎn)電過程及空白對照的pH值，乳酸菌菌數(shù)，葡萄糖濃度和COD去除率的變化。

圖2 產(chǎn)電過程中各參數(shù)的變化：a）pH值；b）乳酸菌菌數(shù)；c）葡萄糖濃度；d）COD去除率Fig.2 Each parameter changers in the process of producing electricity：a）pH value； b）the number of lactic acid bacteria； c）glucose concentration；d）removal rate of COD

張培遠(yuǎn)等［17］發(fā)現(xiàn)，隨著 MFC的運(yùn)行，陽極液的pH值會呈現(xiàn)下降的趨勢，然而由圖2a）可知產(chǎn)電過程和空白對照的pH值變化均不明顯，出現(xiàn)這樣的結(jié)果是由于溶液中均存在著磷酸鹽緩沖液。由圖2b）可知，產(chǎn)電和非產(chǎn)電實(shí)驗(yàn)的乳酸菌數(shù)總體均為增長，但產(chǎn)電比非產(chǎn)電實(shí)驗(yàn)乳酸菌菌數(shù)波動要大些，到第6 d隨著葡萄糖的消耗乳酸菌菌數(shù)均開始減少。從圖2c）中可以看出兩者葡萄糖濃度的下降趨勢相同，而產(chǎn)電過程中消耗的葡萄糖量低于空白對照。從圖2d）中可以看出，隨著時(shí)間的延長，COD的去除率均在增加，并且產(chǎn)電過程的COD去除率要低于空白對照實(shí)驗(yàn)。圖2c）和圖2d）說明產(chǎn)電過程提高了乳酸菌對能量的利用率，減少了葡萄糖的消耗。

產(chǎn)電過程中乳酸菌菌數(shù)有變化，但是由圖1a）可知，MFC的開路電壓沒有受菌數(shù)波動的影響而發(fā)生明顯變化，這說明溶液中的細(xì)菌對產(chǎn)電的貢獻(xiàn)微乎其微，對產(chǎn)電起主要作用的是陽極生物膜的細(xì)菌。根據(jù)連靜等［18-19］的發(fā)現(xiàn)，電流達(dá)到穩(wěn)定平臺的時(shí)間就是微生物吸附在電極上并形成成熟生物膜所需的時(shí)間，電流的大小受生物膜的影響。生物膜形成初期，微生物與接觸面之間以及微生物之間相互作用，一旦足夠多的細(xì)胞聚集起來，細(xì)胞通過分泌的胞外物質(zhì)將彼此連接而形成生物膜。MFC產(chǎn)生電壓主要是由于細(xì)菌吸附在電極表面而致，并不是由于懸浮在溶液中的細(xì)菌所致，所以菌數(shù)的變化對開路電壓影響不大。但是溶液中的細(xì)菌數(shù)與COD去除率有著一定的關(guān)系，當(dāng)電池運(yùn)行初期或細(xì)菌呈對數(shù)生長期間，COD的去除率也迅猛升高。細(xì)菌生長的初期及對數(shù)期均需要大量的營養(yǎng)物質(zhì)來進(jìn)行合成代謝，以提供自身生長必須得核糖體、酶類和ATP等，因此最初和對數(shù)生長期COD大量消耗，之后細(xì)菌進(jìn)入生長穩(wěn)定期，COD下降緩慢。在MFC產(chǎn)電過程中，隨著葡萄糖濃度的降低，開路電壓并未隨之明顯下降，分析其原因：一部分是因?yàn)槠咸烟且呀?jīng)轉(zhuǎn)化為代謝中間產(chǎn)物，這些中間產(chǎn)物進(jìn)一步代謝產(chǎn)生電能；另一部分是由于葡萄糖消耗完后，有機(jī)底物不足，細(xì)胞內(nèi)源呼吸的作用。

2.3 乳酸菌產(chǎn)電過程中代謝產(chǎn)物含量變化

圖 3a），圖 3b），圖 3c）和圖 3d）分別是酵母菌MFC產(chǎn)電過程及空白對照溶液中的乙醛、乙醇、乙酸和乳酸含量的變化。

對于乙醛的含量變化，在空白對照中，乙醛的產(chǎn)量在1周內(nèi)相對較穩(wěn)定，在0.1 g/L左右，而在參與產(chǎn)電的樣品中，乙醛的產(chǎn)量在第2 d達(dá)到最高值，第4 d再次達(dá)到一次高值。對于乙醇的含量變化，在空白對照中乙醇的產(chǎn)量在1周的時(shí)間內(nèi)較穩(wěn)定，在0.02 g/L左右，而在參與產(chǎn)電的樣品中，乙醇的含量明顯高于空白對照中乙醇含量。在空白對照中，乙醛和乙醇的含量均相對較穩(wěn)定，說明乳酸菌在以葡萄糖為底物而非產(chǎn)電的情況下，各反應(yīng)達(dá)到相對平衡，整個(gè)體系處于穩(wěn)定狀態(tài)。而乳酸菌在產(chǎn)電過程中，乙醇含量明顯較高，說明產(chǎn)電環(huán)境可能會促進(jìn)乳酸菌的異型乳酸發(fā)酵的經(jīng)典途徑。在空白對照中，乙酸的含量先由低到高，經(jīng)再次升高后下降，最后又升高，總體上不穩(wěn)定。在產(chǎn)電樣品中，乙酸含量也是先升高再降低。乳酸的產(chǎn)量無論是在非產(chǎn)電的正常代謝途徑，還是參與產(chǎn)電的代謝途徑，均比較低，均低于0.1 g/L，但是變化趨勢均為先升高，再降低，再緩慢升高。但是在空白對照中，高峰的出現(xiàn)要遲于產(chǎn)電的分析樣品，這說明產(chǎn)電環(huán)境促進(jìn)乳酸的生成。

圖3 乳酸菌M FC產(chǎn)電過程各代謝產(chǎn)物含量變化Fig.3 The content changes of acetaldehyde in the lactic acid bacteria MFC power production process

2.4 結(jié)果與分析

在產(chǎn)電和非產(chǎn)電過程中，均檢測到乙醛、乙醇、乙酸和乳酸的存在，因此代謝中均可能涉及到乳酸菌的同型乳酸發(fā)酵途徑、異型乳酸發(fā)酵的經(jīng)典途徑和雙歧桿菌途徑，見圖4。假設(shè)乳酸菌產(chǎn)電過程中只涉及這幾種途徑中的一種，根據(jù)各種代謝產(chǎn)物的量來計(jì)算參與各反應(yīng)的葡萄糖量，這卻是沒有解的一組方程組。從而推斷，乳酸菌在MFC中的代謝可能是多種途徑的共同結(jié)果。

為了判斷可能的主要產(chǎn)電途徑，設(shè)計(jì)試驗(yàn)在產(chǎn)電過程中人為添加乙醇。乳酸菌MFC開路電壓穩(wěn)定在480 mV，在第2 d添加乙醇濃度為2 g/L。圖5是MFC添加乙醇前后各項(xiàng)數(shù)據(jù)的變化情況。

由圖5可知添加乙醇后電壓在0.2 d之內(nèi)急劇下降，降至320 mV之后仍繼續(xù)緩慢下降，在添加2 d之后電壓降至154 mV。添加乙醇之后，溶液的pH值略有升高，乳酸菌正常生長。產(chǎn)電樣品中，加入乙醇之后乙醇、乙醛、乙酸和乳酸的變化均較明顯。加入乙醇之前，乙醛含量較低，加入乙醇之后產(chǎn)電樣品中乙醛量增至0.68 g/L，第4 d稍下降，乙醇量變化與之相反。乙酸和乳酸均是在加入乙醇后的1 d內(nèi)變化不大，2 d后急劇升高。

圖4 乳酸菌發(fā)酵途徑Fig.4 Fermentation pathway of lactic acid bacteria

在3種發(fā)酵途徑中，生成乙醇的途徑是異型乳酸發(fā)酵之經(jīng)典途徑。在體系中人為添加乙醇之后，由化學(xué)平衡可知，生成乙醇的正反應(yīng)受到了一定程度的阻礙，而其逆反應(yīng)則在一定程度上進(jìn)行，因此加入乙醇之后導(dǎo)致了乙醛和乳酸的大量積累。乳酸的增多導(dǎo)致溶液的pH值下降，進(jìn)而影響乙酸的形成。乳酸菌MFC加入乙醇之后電壓先急劇下降之后又緩慢下降，這說明乙醇的添加不利于產(chǎn)電，乙醇的加入抑制了異型乳酸發(fā)酵經(jīng)典途徑，阻斷了電子的傳遞，從而導(dǎo)致了電壓的降低。因此可以推斷，該途徑（異型乳酸發(fā)酵之經(jīng)典途徑）是乳酸菌進(jìn)行產(chǎn)電的主要代謝途徑。

微生物與電極之間的直接接觸是MFC電子轉(zhuǎn)移的主要途徑之一，生物膜上的微生物自身可以產(chǎn)生可溶性氧化還原電子中介體，可溶性中介體分散在陽極表面生物膜中參與底物的轉(zhuǎn)化和電子的傳遞［20］，細(xì)菌均是利用細(xì)胞分泌的多糖等物質(zhì)將其與碳纖維連接起來的。為了看清乳酸菌的形貌，對乳酸菌的生物膜電極做環(huán)境掃描電鏡分析。圖6是乳酸菌的SEM照片，可以看出，乳酸菌黏附在碳纖維表面，實(shí)驗(yàn)過程中并沒有外加中介體，得到了較高的開路電壓，說明乳酸菌可以通過自身將電子轉(zhuǎn)移到電極表面。

圖5 M FC添加乙醇后各項(xiàng)數(shù)據(jù)Fig.5 Open-Circuit voltage in MFC

3 結(jié)論

1）30℃條件下，以葡萄糖為唯一的電子供體，初始濃度為1.5 g/L，雙室微生物燃料電池可以連續(xù)產(chǎn)電，開路電壓為500 mV，最大輸出功率密度為393.23 mW/m2，內(nèi)阻約為500Ω。

圖6 乳酸菌生物膜電極的環(huán)境掃描電鏡Fig.6 SEM of the lactic acid bacteria biofilm electrode

2）乳酸菌MFC的數(shù)據(jù)表明，在產(chǎn)電和非產(chǎn)電過程中都有可能涉及到乳酸菌的同型乳酸發(fā)酵途徑、異型乳酸發(fā)酵的經(jīng)典途徑和雙歧桿菌途徑。乙醇的添加實(shí)驗(yàn)表明異型乳酸菌發(fā)酵的經(jīng)典途徑是乳酸菌進(jìn)行產(chǎn)電的主要途徑。

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