王曼茹 何泰東 劉志承

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬深圳市中醫(yī)院藥學(xué)部,深圳518033）

HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定乙肝扶正膠囊中6種有效成分的含量

王曼茹 何泰東 劉志承*

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬深圳市中醫(yī)院藥學(xué)部,深圳518033）

目的 建立同時(shí)測(cè)定乙肝扶正膠囊中6種有效成分含量的方法。方法 采用二極管陣列檢測(cè)器（DAD）波長切換高效液相色譜法。流動(dòng)相為乙腈-甲醇-0.1%醋酸水溶液（梯度洗脫）,檢測(cè)波長為320nm（0～40min）,切換為254nm（40～65min）檢測(cè)5家廠乙肝扶正膠囊的有效成分。結(jié)果 沒食子酸、虎杖苷、二苯乙烯苷、白藜蘆醇、肉桂醛、丹參硐ⅡA6個(gè)有效成分的色譜峰能有效分離,其質(zhì)量濃度分別在0.244～4.88、0.196～3.92、0.272～5.44、0.208～4.16、0.272～5.44、0.200～4.00mg·ml-1范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系（r≥0.99）;其檢出限分別為2.86～8.86ng·ml-1,定量限分別10.06～20.86ng·ml-1,均符合含量測(cè)定要求。5家廠的產(chǎn)品中的6種有效成分均能同時(shí)檢出。結(jié)論 本方法快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好,可用于乙肝扶正膠囊的質(zhì)量控制。

乙肝扶正膠囊;二極管陣列檢測(cè)器;HPLC-DAD法;有效成分;同時(shí)檢測(cè)

乙肝扶正膠囊是乙型肝炎辨證肝腎兩虛治療的常用中成藥,為《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》[1］收載品種,長期以來其質(zhì)量控制只測(cè)定其中某一中藥有效成分,不夠科學(xué)全面,筆者延用乙腈-甲醇-0.1%醋酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫[2］,采用波長切換HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定乙肝扶正膠囊中的6個(gè)有效成分,并用于檢測(cè)5家廠的產(chǎn)品質(zhì)量,結(jié)果令人滿意。

1 儀器與試藥

HPLC1100（美國Agilent公司,包括DAD二極管陳列檢測(cè)器,Agilent Chem-station色譜工作站等）,SCQ2200型超聲波清洗器（上海聲彥超聲儀器有限公司）,SZ293型自動(dòng)雙重純水蒸餾水器（上海亞榮生化儀器廠）,AB404-S型電子天平（瑞士梅特勒—托利多公司）。

甲醇、乙腈（色譜純美國迪馬公司）：其他試劑均為分析純,水為雙蒸水,沒食子酸、虎杖苷、二苯乙烯苷、白藜蘆醇,肉桂醛、丹參硐ⅡA對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院,供含量測(cè)定用,批號(hào)分別為0831-9901、120923-200809、0844-9902、111535-200601、0773-9911、0766-200910）乙肝扶正膠囊（A.廣州白云山中藥廠,批號(hào)：120801;B.重慶東方藥業(yè)股份有限公司,批號(hào)：120802;C.惠州九惠制藥廠,批號(hào)：120903;D.廣東羅浮山制藥有限公司,批號(hào)：120904;E.貴州良濟(jì)藥業(yè)有限公司,批號(hào)：120905）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別稱取已干燥恒重的對(duì)照品適量,分別以甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度分別為沒食子酸2.44mg·ml-1,虎杖苷1.96mg·ml-1,二苯乙烯苷2.72mg·ml-1,白藜蘆醇2.08mg·ml-1,肉桂醛2.72mg·ml-1,丹參酮ⅡA2.00mg·ml-1的對(duì)照品溶液,再分別精密量取各單組分對(duì)照品溶液適量置于同一10ml量瓶中,加甲醇稀至刻度搖勻制成混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取乙肝扶正膠囊10粒取其內(nèi)容物,研細(xì),精密稱取一粒的重量（約0.4～0.5g）,置于10ml量瓶中,加甲醇5ml超聲（頻率：20KHz,功率80W）60min,放冷至室溫,用甲醇釋至刻度搖勻,用微孔濾膜（0.45μm）濾出,備用。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)［2］色譜柱：DiamonsilTMC18（250mm×4.6mm,5μm）;流動(dòng)相乙腈-甲醇-0.1%醋酸水溶液,梯度洗脫,檢測(cè)波長為：320nm（0～40min檢測(cè)沒食子酸、虎杖苷、二苯乙烯苷、白藜蘆醇）;254nm（40～65min檢測(cè)、肉桂醛、丹參酮ⅡA）;流速：1.0ml/min;柱溫：30℃;進(jìn)樣量：20μl。

在上述色譜條件下,分別取混合對(duì)照品溶液,供試品溶液各20μl進(jìn)樣分析。結(jié)果沒食子酸、虎杖苷、二苯乙烯苷、白藜蘆醇、肉桂醛、丹參酮ⅡA6個(gè)色譜峰的分離良好,與相鄰色譜峰的分離度均≥1.5。理論板數(shù)按丹參酮ⅡA峰計(jì)算不低于5000,見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系與檢出限及定量限 精密量取混合對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0ml,分別置10ml量瓶中再用甲醇稀釋至刻度搖勻,取20μl進(jìn)樣,在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)量記錄各自峰面積,以各成分質(zhì)量濃度（X、mg·ml-1）為橫坐標(biāo),相關(guān)的峰面積分值（y）為縱坐標(biāo),繪制各相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,考察線性關(guān)系。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

將上述混合對(duì)照品溶液繼續(xù)稀釋,測(cè)定,檢測(cè)6個(gè)有效成分的最低檢出限和最低定量限,結(jié)果最低檢出限和最低定量限沒食子酸為8.86ng·ml-1和20.86ng·ml-1虎杖;苷為4.56ng·ml-1和16.76ng·ml-1;二苯乙烯苷為3.96ng·ml-1和12.67ng·ml-1;白藜蘆醇為3.05ng·ml-1和11.98ng·ml-1;肉桂醛為7.68ng·ml-1和18.55ng· ml-1;丹參酮ⅡA為2.86ng·ml-1和10.06ng·ml-1。

2.3.2 含量測(cè)定方法學(xué)考察 按規(guī)定方法進(jìn)行含量測(cè)定相關(guān)方法學(xué)考察,結(jié)果表明精密度試驗(yàn)RSD分別在1.56%～1.93%;重復(fù)性試驗(yàn)RSD分別在1.51%～1.88%;加樣回收試驗(yàn),三個(gè)水平加樣平均回收率沒食子酸、虎杖苷、二苯乙烯苷、白藜蘆醇、肉桂醛、丹參酮ⅡA分別為98.34%、97.70%、98.81%、99.98%、99.32%和99.34%,其RSD則分別1.62%、1.46%、1.55%、1.26%、1.36%和1.42%（n=3）,均符合含量測(cè)定的要求。

2.4 樣品含量測(cè)定 分別取5家廠的乙肝扶正膠囊內(nèi)容物約0.5g,精密稱定按“2.1.2”項(xiàng)下分別制備供試品溶液,在“2.2”色譜條件進(jìn)行測(cè)定,記錄峰面積（n=3）取平均值,依法計(jì)算各廠家樣品中6種有效成成的含量。

表2 5家廠的樣品含量測(cè)定結(jié)果（n,%）

3 討論

《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》收載的乙肝扶正膠囊的檢測(cè)及目前文獻(xiàn)中的乙肝扶正膠囊一般都是采用HPLC測(cè)定其中的單一成分,只有張碩旭等[2］采用梯度洗脫法將其中6個(gè)有效成分分離測(cè)定,筆者則采用HPLC-DAD波長切換法,在0～40min, 320nm波長切換成40～65min254nm波長,亦像張碩旭一樣同時(shí)分別測(cè)定其中上述6個(gè)有效成分（沒食子酸、虎杖苷、二苯乙烯苷、白藜蘆醇、肉桂醛、參酮ⅡA）的含量,5家廠的乙肝扶正膠囊的6種有效成分均已檢出（見表2）,各廠樣品的6個(gè)有效成分的總含量最高百分率為最低的2.225倍,白藜蘆醇有效成分含量最高百分率為最低百分率的5.24倍。

筆者采用HPLC-DAD波長切換法先進(jìn)技術(shù),DAD二極管陣列檢測(cè)器具有快速提供待測(cè)物的三維圖譜,具有自動(dòng)快速選擇波長檢測(cè)各有效成分的功能,本研究應(yīng)用結(jié)果與feng[3］應(yīng)用本法測(cè)定中成藥益宮膠囊中的10種活性成分的效果相同,亦與曾俊芬等[4］在320nm和280nm波長處切換測(cè)定通脈口服液中5種有效成分相當(dāng),而且測(cè)定結(jié)果與張碩旭等[2］所測(cè)定結(jié)果基本一致,比凌英蓉等[5］前期所測(cè)定的方法先進(jìn)科學(xué),已由單一成分的測(cè)定提高到能同時(shí)測(cè)定其中的6種有效成分。

國內(nèi)外現(xiàn)代研究認(rèn)為,多指標(biāo)定量圖譜具有數(shù)據(jù)全面,圖譜質(zhì)優(yōu)與化學(xué)計(jì)量學(xué)緊密結(jié)合等優(yōu)點(diǎn)特征[6］,能對(duì)中藥復(fù)雜系統(tǒng)全面反映整體質(zhì)量,其在中藥質(zhì)量控制領(lǐng)域中具有良好的應(yīng)用前景[7-8］。筆者建議衛(wèi)生部藥典委員會(huì)能盡量采用現(xiàn)代先進(jìn)科學(xué)技術(shù),改善乙肝扶正膠囊只測(cè)定其單一成分（或少數(shù)成分）的質(zhì)監(jiān)方法,以改進(jìn)和完善衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)。

[1］中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會(huì)·中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第一冊(cè)）[S］.1989：1.

[2］張碩旭,孫冬曉,董立華,等.HPLC法同時(shí)測(cè)定乙肝扶正膠囊中6種化學(xué)成分的含量[J］.中國藥房,2012,23（27）：2546-2549.

[3］Feng C Cai YL.Ruan ZL.Simultaneous determination of active components in traditional Chinese medicine“YIGONG”capsule by RP-HPLC-DAD[J］.Pharm Birned Anal,2008,47（2）：442.

[4］曾俊芬,宋金春,魯建武,等.HPLC同時(shí)測(cè)定通脈口服液中5種有效成分的含量[J］.中國藥學(xué)雜志,2010,45（6）：461.

[5］凌英蓉,郭斌.不同廠家乙肝扶正膠囊的產(chǎn)品質(zhì)量研究[J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2009,4（6）：53.

[6］雷利利,張熙潔,侯林中,等.現(xiàn)代色譜技術(shù)在中藥制劑多指標(biāo)成分質(zhì)量控制中的應(yīng)用[J］.中國藥房,2011,22（39）：3733-3735.

[7］Liang XM.Jin Y.Wang YP.et al.Qualitative and guantitative analysis in guality control of traditional Chinese medicine[J］.J chromatogr A.2009,1216（11）：2033.

[8］Ganzera M.Recent advancement and applications in the analysis of traditional Chinese medicines[J］.Planta Med,2009,75（7）：776.

Simultaneous Determination of 6 Active Ingredients in Yigan Fuzheng Capsules by HPLC-DAD

Wang Manru He Taidong Liu Zhichen?
(Depart of Pharmacy,Shenzhen Hospital of TCM,Guangzhou University of TCM,Shenzhen,Guangdong Province,518033,China)

Objective To establish a method to simultaneously determine the contents of 6 active ingredients in Yigan Fuzheng Capsules.Methods HPLC-DAD with wavelength switching system was used,as the column,acetonitrile-methanol-0.1%acetic acid solution（gradient elution）as the mobile phase,detection wavelengths at 320nm（0～40min）,and at 254min（40～65min）to detect the active ingredients in Yigan Fuzheng Capsules in 5 manufacturers.Results The spectra of the 6 active ingredients were effectively separated,with good linear correlation with peak areas,and the linear ranges were 0.244～4.88mg·ml-1for gallic acid,0.196～3.92mg·ml-1for polygon in,0.272～5.44mg·ml-1for stilbene glycoside,0.208～4.16mg·ml-1for resveratrol,0.272～5.44mg.ml-1for cinnamyl aldehyde and 0.200～4.00mg·ml-1for tanshinoneⅡA（r≥0.99）.The detection limits were 2.86～8.86ng·ml-1,quantization limits were 10.06～20.86ng·ml-1,consistent with the requirements on ingredient contents.The 6 active ingredients could be detected in products of 5 manufacturers.Conclusion The method is rapid,accurate,with good repeatability,which is suitable for quality control of Yigan Fuzheng Capsules.

Yigan Fuzheng capsules;HPLC;DAD;Active ingredients;Simultaneous determination

10.3969/j.issn.1672-2779.2014.01.094

1672-2779（2014）-01-0147-02

??吳義紅 本文校對(duì)：王曼茹

2013-11-13）

*通訊作者