苯并(a）芘對雙齒圍沙蠶抗氧化酶活性和細(xì)胞色素P450基因表達(dá)的影響

趙歡，趙新達(dá)，岳宗豪，周一兵

(大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點實驗室，遼寧大連 116023）

苯并(a）芘對雙齒圍沙蠶抗氧化酶活性和細(xì)胞色素P450基因表達(dá)的影響

趙歡，趙新達(dá)，岳宗豪，周一兵

(大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點實驗室，遼寧大連 116023）

在實驗室條件下，利用誘導(dǎo)試驗分析了不同濃度苯并(a）芘［B(a）P］對雙齒圍沙蠶Perinereis aibuhitensis(體質(zhì)量為1.5 g±0.5 g）細(xì)胞色素P450基因表達(dá)和肌肉組織抗氧化酶活性的影響。結(jié)果表明:雙齒圍沙蠶細(xì)胞色素P450基因表達(dá)與B(a）P誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時間呈正相關(guān)，隨著誘導(dǎo)濃度的增加和暴露時間的延長，表達(dá)量逐步上調(diào);超氧化物歧化酶 (SOD）、過氧化氫酶 (CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶 (GPx）活性均隨B(a）P誘導(dǎo)時間的延長而逐步升高，其中SOD酶活性隨B(a）P濃度的增加出現(xiàn)抑制，CAT和GPx酶活性則與B(a）P濃度呈正相關(guān)。

雙齒圍沙蠶;苯并(a）芘;細(xì)胞色素P450;抗氧化酶

多環(huán)芳烴 (PAHs）是一類由兩個或兩個以上芳香環(huán)以線狀、角狀或簇狀排列構(gòu)成的碳?xì)浠衔?，是最早被發(fā)現(xiàn)和研究的致癌類化合物之一［1］。近年來，隨著社會經(jīng)濟的高速發(fā)展，廢物焚化以及工業(yè)廢氣廢水和生活污水的任意排放等產(chǎn)生了大量的PAHs污染物，它們通過降水和徑流進(jìn)入沿海水域，造成海洋PAHs污染［2］。已有調(diào)查表明，中國主要海域都存在不同程度的PAHs污染［3－4］。PAHs對海洋環(huán)境的影響已成為海洋環(huán)境保護的重要問題，PAHs也成為海洋環(huán)境中優(yōu)先控制和必須檢測的污染物之一。

生物體通過體內(nèi)解毒酶活化代謝異生化學(xué)物質(zhì)是機體主要的適應(yīng)機制之一。已有研究表明，PAHs進(jìn)入生物體后會被CYP450依賴的混合功能氧化酶等氧化代謝，形成親水性中間產(chǎn)物，并產(chǎn)生大量活性氧物質(zhì)。這些中間代謝物會與以谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶為代表的內(nèi)源性分子結(jié)合轉(zhuǎn)化為低毒代謝產(chǎn)物排出體外，而形成的活性氧物質(zhì)則會被包括超氧化物歧化酶 (SOD）、過氧化氫酶 (CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶 (GPx）等在內(nèi)的抗氧化防御酶所清除［5］。Wang 等［6］研究表明，褐菖鮋Sebatiscusmarmoratus的CYP1A蛋白含量，以及SOD和GST酶活性均隨著苯并(a）芘［B(a）P］暴露濃度的增加而增加;Holtha等［7］研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚Danio rerio的CYP1A基因表達(dá)可被 PAHs顯著誘導(dǎo);任加云等［8］研究發(fā)現(xiàn)，在PAHs脅迫下，櫛孔扇貝Chlamys farreri的SOD、CAT、GPx酶活性呈現(xiàn)一定的時間劑量效應(yīng)。PAHs與機體解毒代謝酶之間的劑量效應(yīng)關(guān)系已在魚類、貝類等海洋生物中被大量報道，因此，生物體解毒代謝酶等生理生化指標(biāo)也成為海洋污染監(jiān)測和評價的重要指標(biāo)之一。

多毛類隸屬于環(huán)節(jié)動物門，廣泛棲居于污染物較為匯集的海陸交錯帶沉積質(zhì)中，是具有典型沉積食性的底棲無脊椎動物。多毛類是許多大型海洋生物幼體的優(yōu)質(zhì)餌料，其豐度的大小會影響海洋生態(tài)系統(tǒng)食物鏈的能量流動和物質(zhì)循環(huán)［9］。多毛類對有毒污染物較為敏感，常被用作生態(tài)監(jiān)測的指示生物。近年來，國外學(xué)者陸續(xù)開展了多毛類外源污染物生物轉(zhuǎn)化的研究，發(fā)現(xiàn)混合功能氧化酶CYP450在多毛類生物轉(zhuǎn)化代謝過程中起著重要作用。已有報道顯示［10－12］:歐洲沙蠶Nereis virens的 CYP342AI基因mRNA水平可被苯并(a）蒽等顯著誘導(dǎo);小頭蟲Capitella capitata的CYP4AT1和CYP331A1基因表達(dá)可被PAHs顯著誘導(dǎo);多齒圍沙蠶Perinereis nuntia的CYP432A1、CYP431A1基因可被PAHs顯著誘導(dǎo)。在國內(nèi)相關(guān)報道尚不多見，本研究中，以廣泛分布的多毛類雙齒圍沙蠶Perinereis aibuhitensis為研究對象，以B(a）P這一典型PAHs作為暴污物，研究了B(a）P暴露對雙齒圍沙蠶體內(nèi)主要抗氧化酶和解毒代謝相關(guān)因子CYP450的影響，探討了B(a）P對雙齒圍沙蠶的致毒機理，旨在為利用多毛類進(jìn)行海洋環(huán)境污染監(jiān)測提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用雙齒圍沙蠶于退潮期采自遼寧省葫蘆島海域，體質(zhì)量為 (1.5±0.5）g，將采集的個體放入塑料箱后迅速帶回實驗室進(jìn)行暫養(yǎng)。暫養(yǎng)期間，每24 h更換一次海水，水溫為 (13±0.5）℃，鹽度為31～32，pH為8.25±0.10。

試驗用分析純B(a）P購于Sigma公司 (純度為99%）;分析純丙酮購于上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司;RNAiso Plus、PrimeScript RT reagent Kit gDNA Eraser、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ均購于TaKaRa公司;考馬斯亮蘭試劑盒、SOD試劑盒、CAT試劑盒和GSH－Px試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 B(a）P暴露試驗 參考文獻(xiàn)［13］中的方法，設(shè)置兩個B(a）P濃度，分別為5、50 μg/L，另設(shè)一空白對照組和體積分?jǐn)?shù)為0.01%的丙酮溶劑對照組。挑取健康沙蠶個體，放入2 L預(yù)先加入500 mL不同濃度B(a）P毒液的塑料杯中，每個杯中放入8尾沙蠶，每個濃度設(shè)置4個重復(fù)。每24 h更換一次新的溶液，整個試驗過程不投喂飼料，試驗期間，水溫維持在 (11±0.5）℃。于試驗開始后第4、7、14天分別從各處理組中隨機取8尾沙蠶，取體壁肌肉組織立即放入超低溫冰箱 (－80℃）中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 CYP4基因表達(dá)的檢測 采用相對定量方法分析B(a）P暴露下雙齒圍沙蠶CYP4基因表達(dá)的規(guī)律，選取β－actin作為內(nèi)參基因。根據(jù)本實驗室前期獲得的雙齒圍沙蠶CYP4和β－actin序列信息［14］，利用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，引物序列信息見表1。

表1 引物序列信息Tab.1 Sequences of primers used in this experiment

將沙蠶體壁研磨成粉末，利用RNAiso Plus試劑盒提取總RNA，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。取500 ng RNA，用PrimeScript RT reagent Kit gDNA Eraser試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。實時定量 PCR反應(yīng)體系 (20 μL）:SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，引物 (10 μmol/L）各0.8 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA 2 μL，滅菌雙蒸水6 μL。

PCR反應(yīng)條件:95℃下預(yù)變性30 s;95℃下變性5 s，60℃下退火30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)［15］。

1.2.3 組織勻漿的制備 取各處理組沙蠶體壁肌肉組織，加入一定量的生理鹽水，制成10%的組織勻漿，于4℃下以2000 r/min離心15 min，取上清液于冰箱 (－20℃）中保存，用于后續(xù)酶活性的檢測。

1.2.4 抗氧化酶活性的測定 各抗氧化酶指標(biāo)的測定按照試劑盒說明書進(jìn)行。采用黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶 (SOD）的活性，酶活力單位定義為:每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時所對應(yīng)的SOD量為1個SOD活力單位(U）。

采用分光光度計法測定過氧化氫酶 (CAT）的活性，酶活力單位定義為:每毫克組織蛋白每秒分解1 μmol H2O2為1個CAT活力單位 (U）。

采用雙硫代對硝苯甲酸 (DTNB）比色法測定谷胱甘肽過氧化物酶 (GPx）的活性，酶活力單位定義為:每毫克蛋白質(zhì)每分鐘使反應(yīng)體系中還原型谷胱甘肽濃度降低1 μmol/L為1個GPx活力單位(U）。

采用考馬斯亮蘭法測定樣品蛋白含量，以牛血清白蛋白 (BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (mean±S.D.）表示，利用SPSS 16軟件對同一取樣時間不同處理組進(jìn)行單因素方差分析，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 暴露于不同B(a）P濃度中的雙齒圍沙蠶CYP4基因表達(dá)的變化

從圖1可以看出，B(a）P脅迫到一定程度可以誘導(dǎo)沙蠶CYP4基因表達(dá)的升高，但是誘導(dǎo)趨勢并不顯著。暴露4 d時，各濃度組沙蠶CYP4基因表達(dá)與對照組相比均無顯著性差異 (P＞0.05）;暴露7 d時，50 μg/L B(a）P濃度組沙蠶CYP4基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào) (P＜0.05），而5 μg/L濃度組CYP4基因表達(dá)與對照組依然無明顯差異 (P＞0.05）;暴露14 d時，5、50 μg/L濃度組CYP4基因轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)升高。

注:*表示與對照組有顯著性差異 (P＜0.05）;＊＊表示與對照組有極顯著性差異 (P＜0.01），下同Note:* means significant difference compared with the control(P＜0.05）;＊＊ means very significant difference compared with the control(P＜0.01），et sequentia

2.2 暴露于不同B(a）P濃度中雙齒圍沙蠶SOD、CAT、GPx酶活性的變化

從圖2可以看出，溶劑對照組與空白對照組的3種抗氧化酶活性均無明顯差異 (P＞0.05），表明丙酮作為助溶劑對沙蠶沒有明顯的毒性效應(yīng)。在5 μg/L和50 μg/L B(a）P脅迫下，雙齒圍沙蠶SOD酶活性極顯著升高 (P＜0.01），并且隨著脅迫時間的延長酶活性逐漸升高。在5 μg/L B(a）P中暴露4、7、14 d時，SOD酶活力分別為對照組的1.6、1.91、2.61倍;而在50 μg/L B(a）P中暴露4、7、14 d時，SOD酶活力分別為對照組的1.32、1.47、1.84倍?？梢钥闯?，5 μg/L B(a）P暴露組酶活性的升高趨勢較50 μg/L濃度組明顯。

從圖2可以看出，在5、50 μg/L濃度組中，CAT酶活性呈現(xiàn)明顯的上升趨勢 (P＜0.05），且CAT酶活性變化與暴露時間存在顯著的正相關(guān)。在5 μg/L B(a）P中暴露4、7、14 d時，CAT酶活性分別為對照組的1.10、1.33、1.54倍;在50 μg/L B(a）P中暴露4、7、14 d時，酶活性分別為對照組的1.59、1.76、2.13倍。這一變化趨勢與SOD酶活性的變化特征存在明顯差異。

與SOD和CAT酶活變化規(guī)律相比，B(a）P脅迫下雙齒圍沙蠶GPx酶活性的變化幅度最大。從圖2可見，沙蠶GPx酶活性隨著B(a）P濃度和暴露時間的增加呈極顯著的升高趨勢 (P＜0.01）。B(a）P各濃度處理組沙蠶GPx酶活性在4 d時已極顯著高于對照組 (P＜0.01），隨著暴露時間的延長，酶活逐步升高。在5 μg/L和50 μg/L B(a）P脅迫下，雙齒圍沙蠶GPx酶活性在4 d時分別為對照組的3.34、4.61倍，在14 d時，GPx酶活力增加趨勢更加明顯，分別為對照組的4.64、5.70倍。

圖2B(a）P脅迫對雙齒圍沙蠶SOD、CAT、GPx酶活性的影響Fig.2 The effects of B(a）P on activities of SOD，CAT and GPx in sandworm Perinereis aibuhitensis

3 討論

3.1 B(a）P對雙齒圍沙蠶CYP450基因表達(dá)的影響

Jorgensen等［16］指出，多環(huán)芳烴在多毛類體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化過程類似于脊椎動物，亦包括細(xì)胞色素P450酶的氧化代謝和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶的解毒代謝兩個階段。本研究中，雙齒圍沙蠶CYP4基因的表達(dá)隨著B(a）P暴露時間的延長和濃度的增加呈現(xiàn)上升趨勢，表明B(a）P可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)雙齒圍沙蠶CYP4的表達(dá)，但CYP4基因上升趨勢并不顯著，暴露14 d時50 μg/L B(a）P濃度組沙蠶的CYP4基因轉(zhuǎn)錄水平僅為對照組的4.2倍。王振［17］在研究多齒圍沙蠶對B(a）P毒性響應(yīng)中發(fā)現(xiàn)，CYP4A在2.5 μg/L B(a）P誘導(dǎo)下表達(dá)量為對照組的 1203倍，而在 50 μg/L B(a）P誘導(dǎo)下CYP4A表達(dá)量與對照組相近，而CYP4B則無明顯變化。在前期試驗中，作者對獲得的雙齒圍沙蠶CYP4基因進(jìn)行了同源性比對［14］，確定獲得的CYP4基因?qū)儆贑YP4B亞家族。本試驗中CYP4基因表達(dá)與王振［17］的研究結(jié)果有差異，這可能與不同多毛類對多環(huán)芳烴生物轉(zhuǎn)化能力的差別有關(guān)。Rust等［18］比較了6種不同多毛類對苯并芘的生物轉(zhuǎn)化能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6種不同多毛類生物轉(zhuǎn)化效率存在從92%～6%的較大差異性。另外，相比于脊椎動物和昆蟲CYP家族基因在毒性誘導(dǎo)作用下的高表達(dá)水平，雙齒圍沙蠶CYP4基因表達(dá)的誘導(dǎo)程度較低，這一現(xiàn)象與Li等［11］在Capitella capitata中獲得的結(jié)果相近，這種低誘導(dǎo)水平的表達(dá)可能與多毛類CYP酶表達(dá)的低調(diào)控能力有關(guān)。

3.2 B(a）P對雙齒圍沙蠶抗氧化酶活性的影響

污染物經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化過程后會產(chǎn)生一定量的活性氧自由基，如果機體不及時清除會產(chǎn)生氧化損傷。在防御機體氧化損傷過程中，SOD、CAT和GPx 3種酶是起主要作用的抗氧化酶，SOD可以催化氧自由基(O－2·）歧化生成H2O2，CAT可以分解H2O2成為H2O和 O2，GPx可以催化 H2O2分解為H2O或使許多脂質(zhì)過氧化物還原為正常狀態(tài)［19］。本試驗結(jié)果顯示，雙齒圍沙蠶的這3種抗氧化酶活性隨著B(a）P暴露時間的延長均呈明顯的上升趨勢，表明隨著暴露時間的延長機體內(nèi)活性氧自由基大量產(chǎn)生，SOD活性的升高可以消除活性氧自由基，CAT和GPx酶活性的變化趨勢具有一致性，這兩種酶活性的提高可以去除代謝中產(chǎn)生的過氧化氫，從而減少生物體受到氧化損傷的風(fēng)險。這一變化趨勢與其他研究結(jié)果相類似［8，17，20 －22］。

但SOD與CAT和GPx酶活性的變化并不一致，在50 μg/L B(a）P誘導(dǎo)條件下，沙蠶SOD活性的上升趨勢明顯低于5 μg/L B(a）P濃度組，而CAT和GPx活性則與B(a）P濃度呈現(xiàn)正相關(guān)。不少研究表明，SOD、CAT和GPx之間存在一定的正相關(guān)性，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，這3個酶之間不一定存在正相關(guān)。本試驗中產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能與CYP家族在多環(huán)芳烴代謝中的作用有關(guān)。Livingstone等［23］在研究沙丁魚 Limanda limanda的抗氧化酶活性時發(fā)現(xiàn)，SOD和CAT變化趨勢并不一致，推斷成因是由于H2O2的來源不只是SOD催化的歧化反應(yīng)產(chǎn)物，它還可以通過氨基酸或細(xì)胞色素P450氧化酶激活。本試驗中獲得的數(shù)據(jù)與這一結(jié)果相一致，在進(jìn)行B(a）P對雙齒圍沙蠶抗氧化酶活性影響研究的同時，也進(jìn)行了B(a）P對雙齒圍沙蠶CYP450基因表達(dá)的影響分析，發(fā)現(xiàn)B(a）P會誘導(dǎo)該基因的表達(dá)。故推斷在雙齒圍沙蠶中H2O2的來源可能有一部分是通過細(xì)胞色素P450氧化酶來激活的。

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Effects of B(a）P exposure on antioxidant enzyme activity and CYP450 gene expression in sandworm Perinereis aibuhitensis

ZHAO Huan，ZHAO Xin－da，YUE Zong－h(huán)ao，ZHOU Yi－bing
(Key Laboratory of Marine Bio－resources Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

The influence of B(a）P exposure on three different antioxidant enzyme activities and CYP450 gene expression were investigated in sandwormPerinereis aibuhitensiswith body weight of 1.5 g ±0.5 g in an indoor experiment.The CYP450 gene expression was shown to be positively related to exposure time and dosage of B(a）P，with up－regulation with time elapse and increase in B(a）P concentration.There was increase in activities of superoxide dismutase(SOD），catalase(CAT）and glutathione peroxidase(GPx）with increase in B(a）P concentration and the exposure time.SOD activity，however，was exhibited by higher concentration of B(a）P，and the activities of CAT and GPx were shown to be positive relation with the B(a）P concentration.

Perinereis aibuhitensis;B(a）P;CYP450;antioxidant enzyme

X174;Q786

A

10.3969/J.ISSN.2095 －1388.2014.04.004

2095 －1388(2014）04 －0342 －05

2013－11－29

國家海洋局海洋溢油鑒別與損害評估技術(shù)重點實驗室開放基金資助項目 (201217）;海洋公益性項目 (201305002，201305043）;國家自然科學(xué)基金資助項目 (41306138，30901107）

趙歡 (1983—），女，博士，助理研究員。E－mail:zhaohuan@dlou.edu.cn

周一兵 (1957—），男，教授。E－mail:ybzhou@dlou.edu.cn