天然產物通過細胞自噬調節(jié)抑制癌癥的研究進展

張淑芳，王玉芳，袁 紅，陳 寧

（1.武漢體育學院研究生院，湖北 武漢 430079；2.武漢體育學院體育科技學院，湖北 武漢 430205；

3.武漢體育學院健康科學學院，運動干預與健康促進湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430079）

天然產物通過細胞自噬調節(jié)抑制癌癥的研究進展

張淑芳1,2，王玉芳1，袁 紅1，陳 寧3,*

（1.武漢體育學院研究生院，湖北 武漢 430079；2.武漢體育學院體育科技學院，湖北 武漢 430205；

3.武漢體育學院健康科學學院，運動干預與健康促進湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430079）

傳統(tǒng)的化療手段在抑制腫瘤細胞生長的同時也會損傷到正常細胞，所以其臨床治療效果受到很大限制。新型天然產物抗癌化合物基于其安全性和有效性，將會成為人工合成化合物的替代物。臨床前和臨床研究已經(jīng)證實一些植物天然產物（如白藜蘆醇、姜黃素、人參皂苷等）具有抗癌潛力。本文綜述具有代表性的天然產物如何通過靶向細胞內自噬通路誘導腫瘤細胞死亡及其涉及到的信號通路，為其進一步開發(fā)應用于原發(fā)性和轉移性腫瘤的治療提供新的思路。

白藜蘆醇；姜黃素；人參皂苷；自噬；癌癥

大量流行病學調查發(fā)現(xiàn)，多種癌癥的發(fā)生與人們的飲食結構有關，由于生活方式和飲食習慣的改變，癌癥的發(fā)病率逐年提高。目前鑒于許多癌癥的化療效果不甚理想，因此尋找一種新的高效率而毒性低的抗癌藥物顯得尤為迫切。近50年來，從植物、動物、微生物中分離并鑒定出一系列具有強大生理活性的天然產物，其中很大一部分具有很好的抗癌活性。因此，天然化合物必將成為未來癌癥預防和治療的潛在有效藥物。體內和體外研究表明，飲食中的許多物質具有抗癌性能，這些膳食劑通過調節(jié)細胞凋亡和自噬的信號通路從而起到癌癥預防和預防的作用。細胞自噬是一種利用溶酶體對細胞內受損、變性或者衰老的蛋白質以及細胞器進行降解的分解代謝過程。迄今為止，有很多天然產物已被報道通過自噬信號途徑調節(jié)導致癌細胞死亡。本文選擇一些具有代表性的天然產物，綜述其在癌癥治療方面的應用，并總結其針對自噬信號通路的作用機制，以期為臨床癌癥預防與治療提供新的研究思路。

1 自噬的發(fā)生過程

自噬是一種利用溶酶體對細胞內受損、變性或者衰老的蛋白質以及細胞器進行降解的分解代謝過程。正常生理情況下，自噬處于基礎水平，而當細胞面臨營養(yǎng)缺乏、DNA損傷、低氧和其他壓力時，自噬的活性被上調。自噬作為一種機體保護機制能清除多余或受損的細胞器，但自噬過度活化會導致細胞死亡。根據(jù)細胞內底物運送到溶酶體腔內方式的不同，細胞自噬可分為3 種方式：大自噬、小自噬和分子伴侶介導的自噬，通常講的細胞自噬即大自噬。

自噬過程是由自噬相關基因（autophagy related gene，ATG）調節(jié)的，從酵母到哺乳動物，目前發(fā)現(xiàn)的ATG有30多種[1]。Atg1也稱為Unc51樣激酶1（Unc51-like kinase 1，Ulk1），是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，它對自噬的激活起著非常重要。自噬的激活還需要激活Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）蛋白復合物，其組件中包括Atg6（Beclin1基因），PI3K的活化是通過Beclin1與Vps34結合而實現(xiàn)的，其中Vps34起催化作用。

自噬在誘導過程中形成雙層膜囊泡，該膜不斷擴張，形成成熟的囊泡，即自噬小體。自噬小體的形成由兩個泛素樣結合途徑介導：Atg5-Atg12途徑和微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）途徑。磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）與LC3的泛素樣結合會促進LC3從細胞漿易位到自噬小體膜的起始部位；此外，LC3-PE在自噬小體膜上的定位是自噬啟動的可靠標志。缺失Atg5的細胞其自噬的激活受到明顯抑制，提示Atg5-Atg12通路在自噬中的重要作用。

自噬的最后步驟是自噬小體與溶酶體的融合，自噬體降解的內容物由溶酶體水解和回收重新回到細胞質中。使用溶酶體酸化劑（如氯喹）和蛋白酶抑制劑（如胃蛋白酶抑制劑A）會使自噬體在體內聚集，從而產生毒性作用[2]。

圖1 細胞自噬的發(fā)生過程[3]Fig.1 Development and progression of autophagy[3]

2 自噬與癌癥

細胞自噬在細胞生存與死亡中有著雙重作用，從而參與機體的許多生理和病理過程。研究證實，細胞自噬最主要的調節(jié)因子Beclin1在多種癌細胞中缺失，如卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌等[4]；此外，Beclin1基因雜合型小鼠患腫瘤的發(fā)生率比正常小鼠高[4-5]。這些研究表明，當Beclin1基因的表達受到抑制時，癌癥的發(fā)生率增加；研究還發(fā)現(xiàn)，Atg5和LC3突變造成的功能喪失會分別促進骨髓瘤和膠質母細胞瘤的生長[6-7]；另外，還有實驗證明在正常組織中長期慢性地抑制細胞自噬，會激活腫瘤的生成過程[8]，由此可知，自噬功能異常是腫瘤形成與發(fā)展的重要因素。雖然自噬起著一定的腫瘤抑制功能，但腫瘤一旦形成，對營養(yǎng)和能量的需求比正常細胞更高，而腫瘤的微環(huán)境往往會出現(xiàn)營養(yǎng)不良或供應中斷，此時細胞自噬活性的提高可以為癌細胞提供更豐富的營養(yǎng)，促進腫瘤生長[9]。臨床證據(jù)表明，晚期人鼻咽癌標本中，Beclin1基因高表達與生存率呈負相關。缺氧誘導的Beclin1和自噬激活可能使癌細胞存活并可能導致癌癥復發(fā)[10]。90%結直腸癌和胰腺癌病例標本的免疫組織化學結果顯示，在癌組織周邊區(qū)域LC3的高表達與預后不良相關[10-11]。有研究發(fā)現(xiàn)，自噬缺陷會導致腫瘤局部營養(yǎng)缺乏，從而使腫瘤細胞數(shù)目減少[12]。因此，在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中，細胞自噬的作用具有兩面性。

3 與自噬有關的抑癌天然產物

研究發(fā)現(xiàn)眾多的天然產物（圖2）在癌癥防治中起到一定的作用。它們可以調節(jié)機體的氧化應激反應以及影響腫瘤細胞增殖和細胞自噬。

圖2 代表性天然產物的化學結構Fig.2 Chemical structures of representative natural products

3.1 白藜蘆醇

白藜蘆醇（resveratrol，RSV）是一種由植物產生的多酚類物質，主要存在于紅葡萄皮、豌豆、堅果、藍莓、桑葚、蔓越莓、菠菜、百合等植物組織中，化學名稱為3,5,4’-三羥基二苯乙烯（3,5,4’-thrihydroxystilbene），分子式為C14H12O3。RSV的天然存在形式有順式和反式兩種異構體，在植物中主要是反式異構體（圖2），其生理活性要強于順式。早在1997年，就有研究發(fā)現(xiàn)局部應用RSV能使鼠皮膚腫瘤的發(fā)生率下降，從而激發(fā)了人們對RSV抗癌活性的廣泛關注[13]。RSV可對癌癥發(fā)生的3 個階段（起始、增殖、發(fā)生）進行抑制乃至逆轉[14]。在大多數(shù)腫瘤細胞中，誘導細胞發(fā)生凋亡是RSV抗腫瘤效應的主要機制，如RSV能誘導人乳腺癌細胞株T47D發(fā)生凋亡，而對正常外周血淋巴細胞則沒有此作用。利用免疫熒光和聚合酶鏈式反應技術發(fā)現(xiàn)，RSV處理后的人白血病HL-60細胞，其細胞內表現(xiàn)出膜磷脂的不對稱性和DNA片段的損失，且表現(xiàn)出一定的濃度依賴性。研究表明RSV誘導的HL-60細胞死亡與CD95信號傳導依賴性凋亡有關[15]。而近期研究發(fā)現(xiàn)RSV能通過誘導腫瘤細胞自噬性死亡來抑制其生長[16-18]，蛋白免疫印跡法測定結果表明，RSV通過介導Bcl-2和Bcl-xL表達來引發(fā)卵巢癌A2780細胞自噬。RSV處理后的MCF-7細胞中，自噬的經(jīng)典蛋白Beclin1的表達并沒有發(fā)生改變，這提示，與其他天然產物于依賴于Beclin1復合物誘導自噬不同，RSV在乳腺癌細胞中對自噬的誘導是不依賴于Beclin1的[19]。據(jù)報道，PI3K/Akt/mTOR信號轉導途徑是腫瘤細胞存活及凋亡以及新陳代謝重要的信號通路，Akt可通過p-Akt在能量代謝中的作用來抑制AMPK的活化，實現(xiàn)完全抑制TSC2，被抑制TSC2進一步傳遞信息激活mTOR，而RSV通過抑制蛋白激酶B（protein kinase B，PKB或Akt）的磷酸化，抑制了哺乳動物雷帕霉素靶點（mammalian target of rapamycin，mTOR）的底物p70S6K（p70 ribosomal protein S6 kinase）的磷酸化，從而抑制了mTOR信號通路[20]，因此，RSV可以通過調節(jié)PKB和AMPK的活性誘導自噬[21]。利用流式細胞儀監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，RSV使小鼠肝癌細胞（hepatoma 22，H22）S期生長阻滯，從而增強氟尿嘧啶（fluorouradl，5-FU）的抗腫瘤效應，同時還能降低5-FU的毒性[22]。

3.2 姜黃素

姜黃素（curcumin）是從姜科植物姜黃、莪術、郁金等根莖中提取的主要有效成分[23]，這種黃色色素一直作為食品著色劑被人們所利用。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素有非常廣泛的生物學功能，特別是其抗癌作用備受關注。姜黃素可以抑制腫瘤細胞增殖，誘導多種腫瘤細胞的體外凋亡，包括膀胱癌[24]、胰腺癌[25]、前列腺癌[26]、子宮頸癌[27]等，細胞實驗還證實，它在化療和γ射線治療中顯示出良好的藥物性能[28]。Kim等[29]研究了姜黃素對大鼠乳腺癌的抑制作用，當以100、200 mg/kg的劑量進行注射時，姜黃素能夠顯著降低乳腺癌細胞的數(shù)量，同時肝臟谷胱甘肽巰基轉移酶活性沒有受到影響[30]。研究還發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠明顯降低乳腺癌向肺部的轉移，小鼠接種乳腺癌35 d后，非治療組動物肺部都出現(xiàn)癌變，而口服1%的姜黃素后，21%小鼠肺部未出現(xiàn)癌變。Hong等[31]研究證實，小鼠皮下注射具有雄性激素依賴性的前列腺癌細胞后，對照組口服安慰劑，實驗組口服姜黃素5 mg/kg，10 周后，實驗組小鼠腫瘤體積明顯減少，同時腫瘤擴散率明顯下降。據(jù)報道，姜黃素通過誘導細胞自噬從而抑制慢性粒細胞白血病、惡性膠質瘤和食道癌的癌細胞增殖[32-34]。姜黃素能抑制白血病細胞系K562細胞的活力，使K562細胞中LC3-Ⅱ和Beclin1表達水平升高，這表明姜黃素能夠促進自噬體的形成。利用自噬抑制劑巴弗洛霉素A1后，會抑制姜黃素誘導的K562細胞死亡。這些結果表明，姜黃素誘導自噬和K562細胞死亡[33]。在惡性膠質瘤細胞中，發(fā)現(xiàn)姜黃素可以抑制Akt/p70S6K途徑以及激活ERK1/2（extracellular signalregulated kinases），從而誘導自噬[35]。姜黃素能誘導活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成，上調Beclin 1和p53表達水平，激活自噬并最終導致人結腸癌細胞的死亡[36]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶1（serine/ threonine protein phosphatases type-1，PP1）和PP2A是磷酸化作用的重要靶標，姜黃素通過抑制PP1，刺激ERK的磷酸化[34]。除了激活自噬外，姜黃素在抑制K562細胞生長中，還表現(xiàn)出一定的時間和濃度依賴性?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)姜黃素誘導的細胞死亡與凋亡復合物的形成、線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）以及Caspase-3的活化有關，此外，姜黃素的治療還會引起K562細胞中Bcl-2蛋白表達下調[33]。Qian Haoran等[37]研究了姜黃素與阿霉素聯(lián)合治療對人肝癌G2（hepatoma G2，HepG2）細胞的殺傷作用，發(fā)現(xiàn)兩者組合治療與單一治療相比，HepG2活細胞的數(shù)量顯著下降。姜黃素和阿霉素治療后，Hoechst染色能觀察到HepG2細胞凋亡現(xiàn)象，同時檢測到Bcl-2/Bax蛋白的比例下調和Caspase-3的活化。此外，姜黃素還能導致HepG2細胞線粒體的裂解、降低線粒體膜電位、以及自噬的激活。這些結果表明姜黃素可能通過激活線粒體介導的細胞自噬，增強阿霉素對HepG2細胞殺傷率。

3.3 人參皂苷

人參作為滋養(yǎng)品在中國已經(jīng)有幾千年的歷史，《神農本草經(jīng)》一書詳細介紹了人參有“補五臟、安精神、定魂魄、止驚悸、除邪氣、明目開心益智、久服輕身延年”的功效。人參皂苷（ginsenoside）是人參的主要藥理學活性成分。大量研究表明，人參皂苷具有抑制腫瘤細胞生長、抗疲勞、抗衰老、增強機體免疫力、調節(jié)中樞神經(jīng)、改善心腦血管供血不足等作用[38]。國內外學者對人參皂苷預防和抑制腫瘤的作用進行了深入的研究，結果發(fā)現(xiàn)，人參皂苷能夠促進腫瘤細胞的凋亡，促使腫瘤細胞的分化增強，提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，抑制腫瘤新生血管的形成，抑制腫瘤的生長和轉移等方面具有重要作用[39]。目前確定的人參皂苷化合物接近40種，人參皂苷由于其化學結構差異可能會造成藥理學功能的不同，其中最常用的人參皂苷是Rb1、Rg1、Rg3、F2、Rd和Rh1。已報道Rg3和Rh2對各種癌細胞的生長有明顯的抑制作用[40-41]。人參皂苷Rg3能增強癌癥化療的療效，多西他賽、紫杉醇、順鉑、多柔比星等和Rg3聯(lián)合治療能增強結腸癌細胞對化療藥物的敏感性[41]。類似的現(xiàn)象還發(fā)生在前列腺癌細胞中，Rg3和多西紫杉醇組合應用能更有效地誘導細胞凋亡和細胞周期G1期的阻滯[42]。低劑量的環(huán)磷酰胺與Rg3合用能抑制腫瘤微血管的生成，兩藥合用還提高了病人的最長存活率[43]。人參皂苷的抑癌作用可能與其對自噬的調節(jié)作用有關，Ko等[44]研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rk1在體外使HepG2細胞活力下降，抑制HepG2細胞增生。利用不同濃度的Rk1處理后，處于G1期的HepG2細胞從53.3%上升到91.9%。Rk1能夠誘導自噬，共聚焦顯微鏡觀察它使自噬標志物LC3表達增加，特別是LC3-Ⅱ增加明顯，人參皂苷Rk1與自噬抑制劑組合使用，能增強Rk1的抗癌作用。Mai等[45]研究了人參皂苷F2對乳腺癌干細胞增殖活性的抑制作用。F2通過激活內在凋亡途徑和線粒體功能障礙引起人乳腺癌干細胞凋亡。同時，人參皂苷F2可以誘導酸性囊泡的形成，募集GFP-LC3-Ⅱ到自噬體，并且使Atg7的表達水平升高，這表明人參皂苷F2啟動了乳腺癌干細胞中的自噬進程，利用自噬抑制劑可以增強F2誘導的細胞死亡。

3.4 兒茶素

兒茶素是綠茶的主要成分，其有效生物學成分為表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）。在一定的生理范圍內，EGCG在不影響到正常細胞的情況下，能夠誘導多種癌細胞凋亡，并且使癌細胞生長周期停滯[46]。EGCG和環(huán)氧合酶-2抑制劑聯(lián)合治療前列腺癌能抑制癌細胞生長、激活Caspases、誘導癌細胞凋亡和抑制NF-κB的活性。EGCG預處理導致細胞死亡的信號調制級聯(lián)反應非常復雜，涉及到Fas相關蛋白（Fasassociated protein with death domain，F(xiàn)ADD）和FLICE抑制蛋白。EGCG通過依賴于P53的信號通路使同基因系細胞的生長周期收到抑制，同時誘導前列腺癌細胞的凋亡。EGCG發(fā)揮作用與兩個蛋白的功能密切相關：p21和Bax，其中任何一個蛋白下調都有利于細胞的生長[47]。

利用前列腺癌細胞研究發(fā)現(xiàn)，EGCG能抑制腫瘤干細胞的自我更新能力。EGCG誘導的腫瘤細胞凋亡是通過激活Caspase-3以及抑制Bcl-2的表達實現(xiàn)[48]。EGCG能顯著抑制人乳腺癌MCF-7細胞中依賴于Fas mRNA和Fas蛋白誘導的抑制蛋白（heregulin，HRG）-β1的表達，此外，還能降低Akt和Erk1/2的磷酸化[49]。在人類表皮樣癌A431細胞中，EGCG能顯著增強A431細胞中Caspases的活性，增加Caspases-3、Caspase-8和Caspase-9的表達。Caspase抑制劑會阻斷EGCG誘導的細胞凋亡。在多發(fā)性骨髓瘤細胞中，EGCG通過誘導死亡相關蛋白激酶2、Fas配體、Fas和Caspase-3的表達，抑制腫瘤細胞的生長及誘導腫瘤細胞凋亡[50]。在人類胰腺癌細胞中，EGCG誘發(fā)Bax基因低聚、線粒體膜去極化以促進細胞色素c釋放到細胞質中、Caspase依賴的細胞凋亡增強[51]。

3.5 大蒜素

大蒜（garlic）是全球廣為使用的日常食物，屬百合科蔥屬，有巨大的藥用價值。大蒜素（allicin）是大蒜中最豐富的成分。大蒜中保健作用最高的當屬有機硫化合物，如蒜氨酸、γ-谷氨酰半胱氨酸以及它們的衍生物。除了這些有機硫化合物，大蒜中還含有豐富的微量元素（鋅、鎂、銅、硒、碘）、蛋白質、膳食纖維、維生素、抗壞血酸和多酚。大蒜用于治療麻風病、腹瀉、便秘、感染等疾病已經(jīng)有非常悠久的歷史。然而，直到20世紀50年代后期Weisberger等[52]研究才發(fā)現(xiàn)從大蒜中提取的硫代亞磺酸酯具有抗腫瘤特性。由于大蒜的治療潛力和現(xiàn)代分析技術的改進，全球出現(xiàn)了很多研究大蒜的研究小組。目前研究已經(jīng)證實，大蒜能夠對抗各種癌細胞，如結腸癌細胞[53]、膠質瘤細胞[54]和肝癌細胞[55]。大部分研究表明，大蒜的抗癌特性與細胞凋亡機制有關，然而，部分研究發(fā)現(xiàn)大蒜可能會引發(fā)自噬現(xiàn)象。例如，大蒜素可以誘導p53介導的細胞自噬，抑制人肝癌細胞株的生存能力。使用免疫印跡觀察到大蒜素能降低HepG2細胞質中p53的表達、抑制PI3K/mTOR信號通路、減弱Bcl-2的表達水平、增加AMPK/TSC2和Beclin1信號轉導途徑的表達[56]。

3.6 其他天然產物

還有一些其他天然產物通過調控自噬誘導癌細胞死亡。紫杉醇，最初是從太平洋紅豆杉樹樹皮中分離出的一種物質，廣泛應用于肺癌、卵巢癌和乳腺癌的治療[57]。紫杉醇的抗癌特性與細胞死亡應答反應有一定的聯(lián)系，它能夠上調細胞自噬的水平，同時抑制細胞凋亡因子的表達[58]。冬凌草甲素，從中草藥冬凌草中分離出來的二萜類化合物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素能夠導致黑色素瘤細胞和宮頸癌細胞死亡，從而抑制腫瘤的生長。冬凌草甲素可以調節(jié)細胞凋亡和細胞自噬中一些轉錄因子，這些轉錄因子抑制腫瘤細胞的增殖[59]。染料木黃銅，大豆異常黃酮中的主要活性因子，已報道具有治療多種類型腫瘤的潛力。染料木黃銅發(fā)揮其抗腫瘤作用是通過抑制Akt的活化而實現(xiàn)的[60]。

4 結 語

天然產物在殺傷癌細胞的同時，對機體未表現(xiàn)出明顯的不利影響，因此可以作為未來理想的化療劑。在過去的幾十年中，已經(jīng)證實植物來源的天然產物（如白藜蘆醇、姜黃素、人參皂苷、大蒜素等）在自噬相關的細胞死亡信號通路及其網(wǎng)絡調節(jié)中起重要作用?？傊?，這些研究強調一個事實，即利用天然產物預防和治療癌癥會成為未來臨床治療的創(chuàng)新策略。

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Natural Compounds: Targeting Pathways of Autophagy as Anticancer Agents

ZHANG Shu-fang1,2, WANG Yu-fang1, YUAN Hong1, CHEN Ning3,*
(1. Graduate School, Wuhan Sports University, Wuhan 430079, China; 2. College of Sports Science and Technology, Wuhan Sports University, Wuhan 430205, China; 3. Hubei Provincial Collaborative Innovation Center for Exercise and Health Promotion, College of Health Science, Wuhan Sports University, Wuhan 430079, China)

Conventional chemotherapeutic agents are often toxic not only to tumor cells, but also to normal cells, limiting their therapeutic efficiency in clinical application. Novel natural anticancer compounds present an attractive alternative to synthetic compounds, based on their favorable safety and efficacy profiles. Pre-clinical and clinical studies have demonstrated that several representative natural compounds such as resveratrol, curcumin, and ginsenosides have anticancer potential. In this review, we summarize how natural compounds target autophagy to lead to cell death. We also discuss some involved core autophagic pathways. Recent advances in the discovery and evaluation of natural compounds as anticancer agents support future pre-clinical and clinical development of these agents for the treatment of primary and metastatic tumors.

resveratrol; curcumin; ginsenosides; autophagy; cancer

TS201.1

A

1002-6630（2014）23-0331-06

10.7506/spkx1002-6630-201423064

2014-09-01

武漢體育學院湖北省楚天學者啟動基金項目

張淑芳（1980—），女，博士研究生，研究方向為運動人體科學。E-mail：272807322@qq.com

*通信作者：陳寧（1972—），男，教授，博士，研究方向為生物化學與分子運動生理學，運動或營養(yǎng)與健康促進。E-mail：nchen510@gmail.com